Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru cele mai bune rezultate, vă recomandăm să utilizați o versiune mai nouă a browserului dvs. (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, afișăm site-ul fără stilizare sau JavaScript.
Creșterea microbiană în răni se manifestă adesea sub formă de biofilme, care interferează cu vindecarea și sunt dificil de eradicat. Noile pansamente cu argint pretind că combat infecțiile rănilor, dar eficacitatea lor antibiofilm și efectele de vindecare independente de infecție sunt în general necunoscute. Folosind modele de biofilm in vitro și in vivo de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa, raportăm eficacitatea pansamentelor generatoare de ioni Ag1+; pansamente Ag1+ care conțin acid etilendiaminotetraacetic și clorură de benzetoniu (Ag1+/EDTA/BC) și pansamente care conțin nitrat de argint (oxisăruri de Ag), care produc ioni Ag1+, Ag2+ și Ag3+ pentru a combate biofilmul plăgii și efectul acestuia asupra vindecării. Pansamentele Ag1+ au avut efecte minime asupra biofilmului plăgii in vitro și la șoareci (C57BL/6j). În schimb, sărurile de Ag oxigenate și pansamentele Ag1+/EDTA/BC au redus semnificativ numărul de bacterii viabile din biofilme in vitro și au demonstrat o reducere semnificativă a componentelor bacteriene și EPS în biofilmele plăgilor de șoareci. Aceste pansamente au avut efecte diferite asupra vindecării rănilor infectate cu biofilm și a celor neinfectate cu biofilm, pansamentele cu sare oxigenată având efecte mai benefice asupra reepitelizării, dimensiunii plăgii și inflamației în comparație cu tratamentele de control și alte pansamente cu argint. Diferitele proprietăți fizico-chimice ale pansamentelor cu argint pot avea efecte diferite asupra biofilmului plăgii și a vindecării, iar acest lucru trebuie luat în considerare la selectarea unui pansament pentru tratamentul rănilor infectate cu biofilm.
Plăgile cronice sunt definite ca „răni care nu reușesc să progreseze prin etapele normale de vindecare într-un mod ordonat și rapid”1. Plăgile cronice creează o povară psihologică, socială și economică pentru pacienți și sistemul de sănătate. Cheltuielile anuale ale NHS pentru tratarea rănilor și a comorbidităților asociate sunt estimate la 8,3 miliarde de lire sterline în perioada 2017-20182. Plăgile cronice reprezintă, de asemenea, o problemă presantă în prezent în Statele Unite, Medicare estimând costul anual al tratării pacienților cu răni la 28,1-96,8 miliarde de dolari3.
Infecția este un factor major care împiedică vindecarea rănilor. Infecțiile se manifestă adesea sub formă de biofilme, care sunt prezente în 78% din rănile cronice care nu se vindecă. Biofilmele se formează atunci când microorganismele se atașează ireversibil de suprafețe, cum ar fi suprafețele rănilor, și se pot agrega pentru a forma comunități extracelulare producătoare de polimeri (EPS). Biofilmul rănii este asociat cu un răspuns inflamator crescut care duce la deteriorarea țesuturilor, ceea ce poate întârzia sau preveni vindecarea4. Creșterea afectării țesuturilor se poate datora parțial activității crescute a metaloproteinazelor matriceale, colagenazei, elastazei și speciilor reactive de oxigen5. Mai mult, celulele inflamatorii și biofilmele sunt ele însele mari consumatori de oxigen și, prin urmare, pot provoca hipoxie tisulară locală, epuizând celulele de oxigenul vital necesar pentru repararea eficientă a țesuturilor6.
Biofilmele mature sunt foarte rezistente la agenții antimicrobieni, necesitând strategii agresive pentru a controla infecțiile cu biofilm, cum ar fi tratamentul mecanic urmat de un tratament antimicrobian eficient. Deoarece biofilmele se pot regenera rapid, antimicrobienele eficiente pot reduce riscul de reformare după debridarea chirurgicală7.
Argintul este din ce în ce mai utilizat în pansamentele antimicrobiene și este adesea folosit ca tratament de primă linie pentru rănile infectate cronice. Există numeroase pansamente cu argint disponibile comercial, fiecare conținând o compoziție, concentrație și matrice de bază diferite ale argintului. Progresele în domeniul brățărilor cu argint au condus la dezvoltarea de noi brățări cu argint. Forma metalică a argintului (Ag0) este inertă; pentru a obține eficacitate antimicrobiană, trebuie să piardă un electron pentru a forma argint ionic (Ag1+). Pansamentele tradiționale cu argint conțin compuși de argint sau argint metalic care, atunci când sunt expuse la lichid, se descompun pentru a forma ioni Ag1+. Acești ioni Ag1+ reacționează cu celula bacteriană, eliminând electroni din componentele structurale sau procesele critice necesare pentru supraviețuire. Tehnologia brevetată a condus la dezvoltarea unui nou compus de argint, oxisărurile de Ag (nitrat de argint, Ag7NO11), care este inclus în pansamentele pentru răni. Spre deosebire de argintul tradițional, descompunerea sărurilor care conțin oxigen produce stări de argint cu valență mai mare (Ag1+, Ag2+ și Ag3+). Studiile in vitro au arătat că concentrațiile scăzute de săruri de argint oxigenate sunt mai eficiente decât argintul cu un singur ion (Ag1+) împotriva bacteriilor patogene precum Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus și Escherichia coli8,9. Un alt tip nou de pansament cu argint include ingrediente suplimentare, și anume acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) și clorură de benzetoniu (BC), despre care se spune că vizează biofilmul EPS și, prin urmare, cresc penetrarea argintului în biofilm. Aceste noi tehnologii cu argint oferă noi modalități de a viza biofilmele plăgilor. Cu toate acestea, impactul acestor antimicrobiene asupra mediului plăgii și a vindecării independente de infecție este important pentru a se asigura că acestea nu creează un mediu nefavorabil al plăgii sau nu întârzie vindecarea. Au fost raportate îngrijorări cu privire la citotoxicitatea argintului in vitro în cazul mai multor pansamente cu argint10,11. Cu toate acestea, citotoxicitatea in vitro nu s-a tradus încă în toxicitate in vivo, iar mai multe pansamente cu Ag1+ au demonstrat un profil de siguranță bun12.
Aici, am investigat eficacitatea pansamentelor cu carboximetilceluloză care conțin formulări noi de argint împotriva biofilmului rănilor in vitro și in vivo. În plus, au fost evaluate efectele acestor pansamente asupra răspunsurilor imune și vindecării independente de infecție.
Toate pansamentele utilizate au fost disponibile comercial. Pansamentul cu fibre de gel 3M Kerracel (3M, Knutsford, Marea Britanie) este un pansament cu fibre de gel 100% carboximetilceluloză (CMC), non-antimicrobian, care a fost utilizat ca pansament de control în acest studiu. Au fost evaluate trei pansamente antimicrobiene cu argint CMC, și anume pansamentul 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Marea Britanie), care conține 1,7% în greutate sare de argint oxigenată (Ag7NO11) în ioni de argint cu valență superioară (Ag1+, Ag2+ și Ag3+). În timpul descompunerii Ag7NO11, se formează ioni de Ag1+, Ag2+ și Ag3+ într-un raport de 1:2:4. Pansament Aquacel Ag Extra care conține 1,2% clorură de argint (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Marea Britanie) 13 și pansament Aquacel Ag + Extra care conține 1,2% clorură de argint (Ag1+), EDTA și clorură de benzetoniu (ConvaTec, Deeside, Marea Britanie) 14.
Tulpinile utilizate în acest studiu au fost Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) și Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bacteriile au fost cultivate peste noapte în bulion Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Marea Britanie). Cultura acumulată peste noapte a fost apoi diluată 1:100 în bulion Mueller-Hinton și 200 µl au fost depuse pe membrane sterile cicloporoase Whatman de 0,2 µm (Whatman plc, Maidstone, Marea Britanie) pe plăci de agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Marea Britanie).) Formarea de biofilm colonial la 37°C timp de 24 de ore. Aceste biofilme coloniale au fost testate pentru contracție logaritmică.
Tăiați pansamentul în bucăți pătrate de 3 cm2 și umeziți-le în prealabil cu apă deionizată sterilă. Așezați bandajul peste biofilmul coloniei de pe placa de agar. Fiecare 24 ha de biofilm a fost îndepărtat, iar bacteriile viabile din biofilm (UFC/ml) au fost cuantificate prin diluție serială (10−1 până la 10−7) în bulion de neutralizare Day-Angle (Merck-Millipore). După 24 de ore de incubare la 37°C, s-au efectuat numărători standard pe plăci de agar Mueller-Hinton. Fiecare tratament și punct de timp a fost efectuat în triplicat, iar numărătorile pe plăci au fost repetate pentru fiecare diluție.
Pielea de burtă de porc este obținută de la porci femele de rasă Large White în termen de 15 minute de la sacrificare, în conformitate cu standardele de export ale Uniunii Europene. Pielea a fost rasă și curățată cu șervețele cu alcool, apoi congelată la -80°C timp de 24 de ore pentru a o devitaliza. După decongelare, bucăți de piele de 1 cm2 au fost spălate de trei ori cu PBS, hipoclorit de sodiu 0,6% și etanol 70% timp de 20 de minute de fiecare dată. Înainte de a îndepărta epiderma, îndepărtați orice reziduu de etanol prin spălare de 3 ori în PBS steril. Pielea a fost cultivată pe o placă cu 6 godeuri, cu o membrană de nailon (Merck-Millipore) cu grosimea de 0,45 μm deasupra și 3 tampoane absorbante (Merck-Millipore) conținând 3 ml de ser fetal bovin (Sigma) suplimentat cu 10% mediu Dulbecco modificat Eagle (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Biofilmele coloniale au fost cultivate așa cum s-a descris pentru studiile de expunere la biofilm. După cultivarea biofilmului pe membrană timp de 72 de ore, biofilmul a fost aplicat pe suprafața pielii folosind o ansă de inoculare sterilă, iar membrana a fost îndepărtată. Biofilmul a fost apoi incubat pe dermul porcului timp de încă 24 de ore la 37°C pentru a permite biofilmului să se maturizeze și să adere la pielea porcului. După ce biofilmul s-a maturat și s-a atașat, un pansament de 1,5 cm2, pre-umezit cu apă distilată sterilă, a fost aplicat direct pe suprafața pielii și incubat la 37°C timp de 24 de ore. Bacteriile viabile au fost vizualizate prin colorare, aplicând uniform reactivul de viabilitate celulară PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Marea Britanie) pe suprafața apicală a fiecărui explant și incubându-l timp de 5 minute. Utilizați camera digitală Leica DFC425 pentru a captura instantaneu imagini pe microscopul Leica MZ8. Zonele colorate în roz au fost cuantificate folosind software-ul Image Pro versiunea 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Microscopia electronică cu scanare a fost efectuată așa cum este descris mai jos.
Bacteriile crescute peste noapte au fost diluate 1:100 în bulion Mueller-Hinton. 200 μl de cultură au fost adăugați la o membrană sterilă de ciclopori Whatman de 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Marea Britanie) și plasați pe agar Mueller-Hinton. Plăcile cu biofilm au fost incubate la 37°C timp de 72 de ore pentru a permite formarea biofilmului matur.
După 3 zile de maturare a biofilmului, un bandaj pătrat de 3 cm2 a fost plasat direct pe biofilm și incubat la 37°C timp de 24 de ore. După îndepărtarea bandajului de pe suprafața biofilmului, s-a adăugat 1 ml de PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA) pe suprafața fiecărui biofilm timp de 20 de secunde. Suprafețele au fost uscate înainte de înregistrarea modificărilor de culoare folosind un aparat foto digital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Marea Britanie).
Preparați culturile peste noapte pe agar Mueller-Hinton, transferați coloniile individuale în 10 ml de bulion Mueller-Hinton și incubați pe un agitator la 37°C (100 rpm). După incubarea peste noapte, cultura a fost diluată 1:100 în bulion Mueller-Hinton, iar 300 µl au fost picurați pe o membrană circulară Whatman ciclopor de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Marea Britanie) pe agar Mueller-Hinton și incubați la 37°C în decurs de 72 de ore. Biofilmul matur a fost aplicat pe rană așa cum este descris mai jos.
Toate lucrările cu animale au fost efectuate la Universitatea din Manchester în baza unei licențe de proiect aprobate de Biroul pentru Bunăstarea Animalelor și Revizuire Etică (P8721BD27) și în conformitate cu ghidurile publicate de Ministerul de Interne în cadrul ASPA revizuită din 2012. Toți autorii au respectat ghidurile de sosire. Șoareci C57BL/6j în vârstă de opt săptămâni (Envigo, Oxon, Marea Britanie) au fost utilizați pentru toate studiile in vivo. Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Marea Britanie), iar suprafețele lor dorsale au fost rase și curățate. Fiecare șoarece a primit apoi o plagă excizională de 2 × 6 mm folosind un punch de biopsie Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Marea Britanie). Pentru plăgile infectate cu biofilm, aplicați biofilm colonial de 72 de ore, crescut pe membrană, așa cum este descris mai sus, pe stratul dermal al plăgii, folosind o ansă de inoculare sterilă, imediat după leziune, și aruncați membrana. Un centimetru pătrat de pansament este pre-umezit cu apă sterilă pentru a menține un mediu umed al plăgii. Pansamentele au fost aplicate direct pe fiecare rană și acoperite cu o folie 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Marea Britanie) și adeziv lichid Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicat în jurul marginilor pentru a asigura o aderență suplimentară. Buprenorfina (Animalcare, York, Marea Britanie) a fost administrată la o concentrație de 0,1 mg/kg ca analgezic. Șoarecii au fost sacrificați la trei zile după leziune folosind metoda Schedule 1 și au fost îndepărtați, înjumătățiți și depozitați zona rănii, după cum este necesar.
Colorația cu hematoxilină (ThermoFisher Scientific) și eozină (ThermoFisher Scientific) a fost efectuată conform protocolului producătorului. Zona plăgii și reepitelizarea au fost cuantificate folosind software-ul Image Pro versiunea 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Secțiunile de țesut au fost deparafinate în xilen (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Marea Britanie), rehidratate cu etanol gradat 100-50% și imersate pentru scurt timp în apă deionizată (ThermoFisher Scientific). Imunohistochimia a fost efectuată utilizând kitul VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), conform protocolului producătorului. Anticorpii primari împotriva neutrofilelor NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) și macrofagelor Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Marea Britanie) au fost diluați 1:100 în soluție de blocare și adăugați pe suprafața tăiată, urmați de 2 anticorpi anti-, VectaStain ABC și kitul de substrat Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) și contracolorați cu hematoxilină. Imaginile au fost obținute folosind un microscop Olympus BX43 și o cameră digitală Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Marea Britanie).
Probele de piele au fost fixate în glutaraldehidă 2,5% și formaldehidă 4% în HEPES 0,1 M (pH 7,4) timp de 24 de ore la 4°C. Probele au fost deshidratate folosind etanol gradat și uscate în CO2 folosind un uscător de puncte critice Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Marea Britanie) și acoperite prin pulverizare cu aliaj de aur-paladiu folosind un sistem de mini pulverizare/descărcare luminiscentă Quorum SC7620. Probele au fost imagisticate folosind un microscop electronic cu scanare FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) pentru a vizualiza punctul central al plăgii.
Iodura de Toto-1 (2 μM) a fost aplicată pe suprafața plăgii excizate la șoarece și incubată timp de 5 minute la 37 °C (ThermoFisher Scientific) și tratată cu Syto-60 (10 μM) la 37 °C (ThermoFisher Scientific). Imaginile Z-stack de 15 minute au fost create folosind un aparat foto Leica TCS SP8.
Datele biologice și tehnice replicate au fost tabelate și analizate folosind software-ul Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Analiza varianței într-o singură direcție cu comparații multiple utilizând testul post-hoc Dunnett a fost utilizată pentru a testa diferențele dintre fiecare tratament și pansamentul de control non-antimicrobian. O valoare p <0,05 a fost considerată semnificativă.
Eficacitatea pansamentelor fibroase cu gel de argint a fost evaluată inițial împotriva coloniilor de biofilm de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa in vitro. Pansamentele cu argint conțin diferite formule de argint: pansamentele tradiționale cu argint produc ioni Ag1+; pansamentele cu argint, care pot produce ioni Ag1+ după adăugarea de EDTA/BC, pot distruge matricea biofilmului și pot expune bacteriile la ionii de argint sub efectul antibacterian al acestuia. 15 și pansamentele care conțin săruri de Ag oxigenate care produc ioni Ag1+, Ag2+ și Ag3+. Eficacitatea sa a fost comparată cu un pansament de control non-antimicrobian fabricat din fibre gelificate. Bacteriile viabile rămase în biofilm au fost evaluate la fiecare 24 de ore timp de 8 zile (Figura 1). În ziua 5, biofilmul a fost reinoculat cu 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus sau 1,22×105P. aeruginosa pentru a evalua recuperarea biofilmului. Comparativ cu pansamentele de control non-antimicrobiene, pansamentele Ag1+ au avut un efect minim asupra viabilității bacteriene în biofilmele de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa pe o perioadă de 5 zile. În schimb, pansamentele care conțin Ag oxigenat și săruri Ag1+ + EDTA/BC au fost eficiente în uciderea bacteriilor din biofilm în decurs de 5 zile. După inocularea repetată cu bacterii planctonice în ziua 5, nu s-a observat nicio restaurare a biofilmului (Fig. 1).
Cuantificarea bacteriilor viabile în biofilmele de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa după tratamentul cu pansamente de argint. Coloniile de biofilm de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa au fost tratate cu pansamente de argint sau pansamente de control non-antimicrobiene, iar numărul de bacterii viabile rămase a fost determinat la fiecare 24 de ore. După 5 zile, biofilmul a fost reinoculat cu 3,85×105S. Staphylococcus aureus sau 1,22×105P. Coloniile de bacterioplancton Pseudomonas aeruginosa au fost formate individual pentru a evalua recuperarea biofilmului. Graficele arată media +/- eroarea standard.
Pentru a vizualiza efectul pansamentelor cu argint asupra viabilității biofilmului, acestea au fost aplicate pe biofilme mature crescute pe pielea porcină ex vivo. După 24 de ore, pansamentul este îndepărtat, iar biofilmul este colorat cu un colorant albastru reactiv, care este metabolizat de bacteriile vii într-o culoare roz. Biofilmele tratate cu pansamente de control au fost roz, indicând prezența bacteriilor viabile în biofilm (Figura 2A). În schimb, biofilmul tratat cu pansamentul cu oxizoli de Ag a fost predominant albastru, indicând faptul că bacteriile rămase pe suprafața pielii porcului erau bacterii neviabile (Figura 2B). O colorație mixtă albastră și roz a fost observată în biofilmele tratate cu pansamente care conțin Ag1+, indicând prezența bacteriilor viabile și neviabile în biofilm (Figura 2C), în timp ce pansamentele EDTA/BC care conțin Ag1+ au fost predominant albastre, cu câteva pete roz, indicând zone care nu au fost afectate de pansamentul cu argint (Figura 2D). Cuantificarea zonelor active (roz) și inactive (albastru) a arătat că plasturele de control a fost 75% activ (Figura 2E). Pansamentele Ag1+ + EDTA/BC au avut rezultate similare cu pansamentele cu sare de Ag oxigenată, cu rate de supraviețuire de 13%, respectiv 14%. Pansamentul Ag1+ a redus, de asemenea, viabilitatea bacteriană cu 21%. Aceste biofilme au fost apoi observate folosind microscopia electronică cu scanare (SEM). După tratamentul cu pansamentul de control și pansamentul Ag1+, s-a observat un strat de Pseudomonas aeruginosa care acoperea pielea porcină (Figura 2F,H), în timp ce după tratamentul cu pansamentul Ag1+, s-au găsit puține celule bacteriene și puține celule bacteriene dedesubt. Fibrele de colagen pot fi considerate structura țesutului pielii porcine (Figura 2G). După tratamentul cu pansament Ag1+ + EDTA/BC, plăcile bacteriene și plăcile de fibre de colagen subiacente au fost vizibile (Figura 2I).
Vizualizarea biofilmului de Pseudomonas aeruginosa după tratamentul cu pansamente de argint. (A–D) Viabilitatea bacteriană în biofilmele de Pseudomonas aeruginosa crescute pe piele de porc a fost vizualizată folosind colorantul de viabilitate PrestoBlue la 24 de ore după tratamentul cu pansamente de argint sau pansamente de control non-antimicrobiene. Bacteriile vii sunt roz, bacteriile neviabile și pielea de porc sunt albastre. (E) Cuantificarea biofilmelor de Pseudomonas aeruginosa crescute pe piele de porc (pată roz) folosind microscopia electronică cu scanare Image Pro versiunea 10 (FI) și tratate cu un pansament de argint sau un pansament de control non-antimicrobian timp de 24 de ore. Scara SEM = 5 µm. (J–M) Biofilmele coloniale au crescut pe filtre și au fost colorate cu colorant reactiv PrestoBlue după 24 de ore de incubare cu pansamente de argint.
Pentru a determina dacă contactul strâns dintre pansamente și biofilme a afectat eficacitatea pansamentelor, biofilme coloniale plasate pe o suprafață plană au fost tratate cu pansamente timp de 24 de ore și apoi colorate cu coloranți reactivi. Biofilmul netratat a avut o culoare roz închis (Figura 2J). Spre deosebire de biofilmele tratate cu pansamente care conțin săruri de Ag oxigenate (Figura 2K), biofilmele tratate cu pansamente care conțin Ag1+ sau Ag1+ + EDTA/BC au prezentat benzi de colorare roz (Figura 2L,M). Această colorație roz indică prezența bacteriilor viabile și este asociată cu zona de sutură din interiorul pansamentului. Aceste zone cusute creează spații moarte care permit bacteriilor din biofilm să supraviețuiască.
Pentru a evalua eficacitatea pansamentelor cu argint in vivo, rănile excizate pe toată grosimea șoarecilor infectați cu biofilme mature de S. aureus și P. aeruginosa au fost tratate cu pansamente de control non-antimicrobiene sau pansamente cu argint. După 3 zile de tratament, analiza macroscopică a imaginii a arătat dimensiuni mai mici ale plăgilor atunci când au fost tratate cu pansamente cu sare oxigenată, comparativ cu pansamentele de control non-antimicrobiene și alte pansamente cu argint (Figura 3A-H). Pentru a confirma aceste observații, rănile au fost recoltate, iar zona plăgii și reepitelizarea au fost cuantificate pe secțiuni de țesut colorate cu hematoxilină și eozină folosind software-ul image pro versiunea 10 (Figura 3I-L).
Efectul pansamentelor de argint asupra suprafeței plăgii și reepitelizarea plăgilor infectate cu biofilme. (A–H) Celule mici infectate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa (A–D) și Staphylococcus aureus (E–H) după trei zile de tratament cu un pansament de control non-antimicrobian, un pansament cu sare de Ag oxigenată, un pansament Ag1+ și un pansament Ag1+. Imagini macroscopice reprezentative. Plăgi la șoareci cu pansament Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infecție reprezentativă cu Pseudomonas aeruginosa, secțiuni histologice colorate cu hematoxilină și eozină, utilizate pentru cuantificarea suprafeței plăgii și a regenerării epiteliale. Cuantificarea suprafeței plăgii (M, O) și procentul de reepitelizare (N, P) a plăgilor infectate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa (M, N) și Staphylococcus aureus (O, P) (per grup de tratament n = 12). Graficele arată media +/- eroarea standard. * înseamnă p = < 0,05 ** înseamnă p = < 0,01; Scară macroscopică = 2,5 mm, scară histologică = 500 µm.
Cuantificarea suprafeței plăgii în plăgile infectate cu biofilm de Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) a arătat că plăgile tratate cu săruri oxi de Ag au avut o dimensiune medie a plăgii de 2,5 mm2, în timp ce pansamentul de control non-antimicrobian a avut o dimensiune medie a plăgii de 3,1 mm2, ceea ce nu este adevărat. a atins semnificație statistică (Figura 3M). p = 0,423). Plăgile tratate cu Ag1+ sau Ag1+ + EDTA/BC nu au arătat nicio reducere a suprafeței plăgii (3,1 mm2 și, respectiv, 3,6 mm2). Tratamentul cu pansament cu sare de Ag oxigenată a promovat reepitelizarea într-o măsură mai mare decât pansamentul de control non-antimicrobian (34% și, respectiv, 15%; p = 0,029) și Ag1+ sau Ag1+ + EDTA/BC (10% și 11%) (Figura 3N). . , respectiv).
Tendințe similare în ceea ce privește suprafața plăgii și regenerarea epitelială au fost observate în cazul plăgilor infectate cu biofilme de S. aureus (Figura 3O). Pansamentele care conțin săruri de argint oxigenate au redus suprafața plăgii (2,0 mm2) cu 23% comparativ cu pansamentul de control non-antimicrobian (2,6 mm2), deși această reducere nu a fost semnificativă (p = 0,304) (Fig. 3O). În plus, suprafața plăgii în grupul de tratament cu Ag1+ a fost ușor redusă (2,4 mm2), în timp ce rana tratată cu pansament Ag1+ + EDTA/BC nu a redus suprafața plăgii (2,9 mm2). Sărurile de oxigen ale Ag au promovat, de asemenea, reepitelizarea plăgilor infectate cu biofilm de S. aureus (31%) într-o măsură mai mare decât cele tratate cu pansamente de control non-antimicrobiene (12%, p = 0,003) (Figura 3P). Pansamentul Ag1+ (16%, p = 0,903) și pansamentul Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) au prezentat niveluri de regenerare epitelială similare cu cele din grupul de control.
Pentru a vizualiza efectul pansamentelor cu argint asupra matricei biofilmului, s-a efectuat colorarea cu iodură Toto 1 și Syto 60 (Fig. 4). Iodura Toto 1 este un colorant impermeabil la celule care poate fi utilizat pentru a vizualiza cu precizie acizii nucleici extracelulari, care sunt abundenți în EPS-urile biofilmelor. Syto 60 este un colorant permeabil la celule utilizat ca și contracolorant16. Observațiile iodurii Toto 1 și Syto 60 în plăgi inoculate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) și Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) au arătat că, după 3 zile de tratament cu pansament, EPS-ul din biofilm a fost redus semnificativ. Pansamentele Ag1+ fără componente antibiofilm suplimentare au redus semnificativ ADN-ul liber de celule în plăgile inoculate cu Pseudomonas aeruginosa, dar au fost mai puțin eficiente în plăgile inoculate cu Staphylococcus aureus.
Imagistică in vivo a biofilmului plăgii după 3 zile de tratament cu pansamente de control sau de argint. Imagini confocale ale Pseudomonas aeruginosa (A-D) și Staphylococcus aureus (I-L) colorate cu Toto 1 (verde) pentru a vizualiza acizii nucleici extracelulari, o componentă a polimerilor de biofilm extracelular. Pentru a colora acizii nucleici intracelulari, se utilizează Syto 60 (roșu). acizi. P. Microscopie electronică cu scanare a rănilor infectate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa (E-H) și Staphylococcus aureus (M-P) după 3 zile de tratament cu pansamente de control și de argint. Bara de scală SEM = 5 µm. Bara de scală a imagisticii confocale = 50 µm.
Microscopia electronică cu scanare a arătat că șoarecii inoculați cu colonii de biofilm de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) și Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) au avut semnificativ mai puține bacterii în răni după 3 zile de tratament cu pansamente integrale din argint.
Pentru a evalua efectul pansamentelor cu argint asupra inflamației plăgilor la șoarecii infectați cu biofilm, secțiuni de plăgi infectate cu biofilm tratate cu pansamente de control sau cu argint timp de 3 zile au fost colorate imunohistochimic folosind anticorpi specifici pentru neutrofile și macrofage. Determinarea cantitativă a neutrofilelor și macrofagelor intern. țesut de granulație. Figura 5). Toate pansamentele cu argint au redus numărul de neutrofile și macrofage din plăgile infectate cu Pseudomonas aeruginosa comparativ cu pansamentele de control non-antimicrobiene după trei zile de tratament. Cu toate acestea, tratamentul cu pansament cu sare de argint oxigenată a dus la o reducere mai mare a neutrofilelor (p = <0,0001) și a macrofagelor (p = <0,0001) comparativ cu alte pansamente cu argint testate (Figura 5I,J). Deși Ag1+ + EDTA/BC a avut un efect mai mare asupra biofilmului plăgii, a redus nivelurile de neutrofile și macrofage într-o măsură mai mică decât pansamentul Ag1+. Plăgile moderate infectate cu biofilm de S. aureus au fost observate și după pansarea cu oxisoli de Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) și Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) comparativ cu controlul. Tendințe similare se observă și pentru bandajul cu neutropenie (Fig. 5K). Cu toate acestea, doar pansamentul cu sare de Ag oxigenată a arătat o reducere semnificativă a numărului de macrofage din țesutul de granulație comparativ cu controlul în cazul rănilor infectate cu biofilme de S. aureus (p = 0,0339) (Figura 5L).
Neutrofilele și macrofagele au fost cuantificate în plăgile infectate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus după 3 zile de tratament cu pansamente de control non-antimicrobiene sau cu argint. Neutrofilele (AD) și macrofagele (EH) au fost cuantificate în secțiuni de țesut colorate cu anticorpi specifici pentru neutrofile sau macrofage. Cuantificarea neutrofilelor (I și K) și macrofagelor (J și L) în plăgile infectate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa (I și J) și Staphylococcus aureus (K și L). N = 12 per grup. Graficele prezintă media +/- eroarea standard, valorile de semnificație comparativ cu pansamentul de control non-antibacterian, * înseamnă p = < 0,05, ** înseamnă p = < 0,01; *** înseamnă p = < 0,001; indică p = <0,0001).
Apoi am evaluat efectul pansamentelor cu argint asupra vindecării independente de infecție. Plăgile excizionale neinfectate au fost tratate cu un pansament de control non-antimicrobian sau cu un pansament cu argint timp de 3 zile (Figura 6). Dintre pansamentele cu argint testate, doar plăgile tratate cu pansamentul cu sare oxigenată au apărut mai mici pe imaginile macroscopice decât plăgile tratate cu grupul de control (Figura 6A-D). Cuantificarea suprafeței plăgii utilizând analiza histologică a arătat că suprafața medie a plăgii după tratamentul cu pansamentul cu oxizoli de argint a fost de 2,35 mm2 comparativ cu 2,96 mm2 pentru plăgile tratate cu grupul de control, dar această diferență nu a atins semnificație statistică (p = 0,488) (Fig. 6I). În schimb, nu s-a observat nicio reducere a suprafeței plăgii după tratamentul cu pansamente Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) sau Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) comparativ cu grupul de control. O regenerare epitelială crescută a fost observată cu pansamentul cu oxisol de Ag comparativ cu grupul de control (30% vs. 22%), deși aceasta nu a atins semnificația (p = 0,067), acest lucru este destul de semnificativ și confirmă rezultatele anterioare. Un pansament cu oxisoli promovează reepitelizarea. -Epitelizarea rănilor neinfectate17. În schimb, tratamentul cu pansamente Ag1+ sau Ag1+ + EDTA/BC nu a avut niciun efect sau a demonstrat o reepitelizare scăzută comparativ cu grupul de control.
Efectul pansamentului cu argint asupra vindecării rănilor la șoarecii neinfectați cu rezecție completă. (AD) Imagini macroscopice reprezentative ale rănilor după trei zile de tratament cu un pansament de control non-antimicrobian și un pansament cu argint. (EH) Secțiuni reprezentative ale plăgii colorate cu hematoxilină și eozină. Cuantificarea suprafeței plăgii (I) și procentul de reepitelizare (J) au fost calculate din secțiunile histologice la mijlocul plăgii utilizând software de analiză a imaginilor (n = 11-12 per grup de tratament). Graficele arată media +/- eroarea standard. * înseamnă p = <0,05.
Argintul are o lungă istorie de utilizare ca terapie antimicrobiană în vindecarea rănilor, însă numeroasele formulări și metode de administrare pot duce la diferențe în eficacitatea antimicrobiană 18. Mai mult, proprietățile antibiofilmului ale sistemelor specifice de administrare a argintului nu sunt pe deplin înțelese. Deși răspunsul imun al gazdei este relativ eficient împotriva bacteriilor planctonice, acesta este în general mai puțin eficient împotriva biofilmelor 19. Bacteriile planctonice sunt ușor fagocitate de macrofage, dar în cadrul biofilmelor, celulele agregate prezintă probleme suplimentare prin limitarea răspunsului gazdei în măsura în care celulele imune pot suferi apoptoză și pot elibera factori proinflamatori pentru a spori răspunsul imun 20. S-a observat că unele leucocite pot penetra biofilmele 21, dar nu sunt capabile să fagociteze bacteriile odată ce această apărare este compromisă 22. Ar trebui utilizată o abordare holistică pentru a sprijini răspunsul imun al gazdei împotriva infecției cu biofilmul plăgii. Debridarea plăgii poate perturba fizic biofilmul și poate îndepărta cea mai mare parte a încărcăturii biologice, dar răspunsul imun al gazdei poate fi ineficient împotriva biofilmului rămas, în special dacă răspunsul imun al gazdei este compromis. Astfel, terapiile antimicrobiene, cum ar fi pansamentele cu argint, pot susține răspunsul imun al gazdei și pot elimina infecțiile cu biofilm. Compoziția, concentrația, solubilitatea și substratul de administrare pot influența eficacitatea antimicrobiană a argintului. În ultimii ani, progresele în tehnologia de procesare a argintului au făcut ca aceste pansamente să fie mai eficiente9,23. Pe măsură ce tehnologia pansamentelor cu argint avansează, este important să înțelegem eficacitatea acestor pansamente în controlul infecției plăgilor și, mai important, impactul acestor forme puternice de argint asupra mediului plăgii și a vindecării.
În acest studiu, am comparat eficacitatea a două pansamente avansate cu argint cu pansamente convenționale care produc ioni Ag1+ împotriva biofilmelor, utilizând diferite modele in vitro și in vivo. De asemenea, am evaluat efectul acestor pansamente asupra mediului plăgii și vindecării independente de infecție. Pentru a minimiza influența matricei de administrare, toate pansamentele cu argint testate au fost compuse din carboximetilceluloză.
Evaluarea noastră preliminară a acestor pansamente cu argint împotriva biofilmelor coloniale de Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus arată că, spre deosebire de pansamentele tradiționale Ag1+, două pansamente avansate cu argint, Ag1+ + EDTA/BC și sărurile de Ag oxigenate, sunt eficiente la 5%. Ucid eficient bacteriile din biofilm în câteva zile. În plus, aceste pansamente previn reformarea biofilmului la expunerea repetată la bacterii planctonice. Pansamentul Ag1+ conținea clorură de argint, același compus de argint și aceeași matrice de bază ca Ag1+ + EDTA/BC și a avut un efect limitat asupra viabilității bacteriene din biofilm în aceeași perioadă. Observația că un pansament Ag1+ + EDTA/BC a fost mai eficient împotriva biofilmului decât un pansament Ag1+ constând din aceeași matrice și un compus de argint susține ideea că sunt necesare ingrediente suplimentare pentru a crește eficacitatea clorurii de argint împotriva biofilmului, așa cum s-a raportat și în alte părți15. Aceste rezultate susțin ideea că BC și EDTA joacă un rol suplimentar în contribuția la eficacitatea generală a pansamentelor și că absența acestei componente în pansamentele Ag1+ ar fi putut contribui la eșecul de a demonstra eficacitatea in vitro. Am constatat că pansamentele cu sare de Ag oxigenată care produc ioni Ag2+ și Ag3+ au prezentat o eficacitate antibacteriană mai puternică decât Ag1+ și la niveluri similare cu Ag1+ + EDTA/BC. Cu toate acestea, din cauza potențialului redox ridicat, nu este clar cât timp ionii Ag3+ rămân activi și eficienți împotriva biofilmelor plăgilor și, prin urmare, merită studii suplimentare. În plus, există multe pansamente diferite care generează ioni Ag1+ care nu au fost testate în acest studiu. Aceste pansamente sunt compuse din diferite compuși de argint, concentrații și matrici de bază, care pot influența livrarea ionilor Ag1+ și eficacitatea acestora împotriva biofilmelor. De asemenea, este de remarcat faptul că există multe modele in vitro și in vivo diferite utilizate pentru a evalua eficacitatea pansamentelor împotriva biofilmelor. Tipul de model utilizat, precum și conținutul de sare și proteine al mediilor utilizate în aceste modele, vor influența eficacitatea pansamentului. În modelul nostru in vivo, am permis biofilmului să se maturizeze in vitro și apoi l-am transferat pe suprafața dermală a plăgii. Răspunsul imun al șoarecelui gazdă este relativ eficient împotriva bacteriilor planctonice aplicate pe rană, formând astfel un biofilm pe măsură ce rana se vindecă. Adăugarea de biofilm matur la o rană limitează eficacitatea răspunsului imun al gazdei la formarea biofilmului, permițând biofilmului matur să se stabilească în rană înainte de începerea vindecării. Astfel, modelul nostru ne permite să evaluăm eficacitatea pansamentelor antimicrobiene asupra biofilmelor mature înainte ca rănile să înceapă să se vindece.
De asemenea, am constatat că potrivirea pansamentului a influențat eficacitatea pansamentelor cu argint pe biofilmele cultivate in vitro și pe pielea porcină. Contactul strâns cu rana este considerat critic pentru eficacitatea antimicrobiană a pansamentului24,25. Pansamentele care conțin săruri de Ag oxigenate au fost în contact strâns cu biofilmele mature, rezultând o reducere semnificativă a numărului de bacterii viabile din biofilm după 24 de ore. În schimb, atunci când au fost tratate cu pansamente Ag1+ și Ag1+ + EDTA/BC, au rămas un număr semnificativ de bacterii viabile. Aceste pansamente conțin suturi pe întreaga lungime a pansamentului, ceea ce creează spații moarte care împiedică contactul strâns cu biofilmul. În studiile noastre in vitro, aceste zone fără contact au împiedicat uciderea bacteriilor viabile din biofilm. Am evaluat viabilitatea bacteriană numai după 24 de ore de tratament; în timp, pe măsură ce pansamentul devine mai saturat, poate exista mai puțin spațiu mort, reducând zona pentru aceste bacterii viabile. Cu toate acestea, acest lucru subliniază importanța compoziției pansamentului, nu doar a tipului de argint din pansament.
Deși studiile in vitro sunt utile pentru compararea eficacității diferitelor tehnologii cu argint, este important să înțelegem efectele acestor pansamente asupra biofilmelor in vivo, unde țesutul gazdă și răspunsurile imune contribuie la eficacitatea pansamentelor împotriva biofilmelor. Efectul acestor pansamente asupra biofilmelor rănilor a fost observat utilizând microscopia electronică cu scanare și colorarea EPS a biofilmului folosind coloranți ADN intracelulari și extracelulari. Am constatat că, după 3 zile de tratament, toate pansamentele au fost eficiente în reducerea ADN-ului liber în rănile infectate cu biofilm, dar pansamentul Ag1+ a fost mai puțin eficient în rănile infectate cu Staphylococcus aureus. Microscopia electronică cu scanare a arătat, de asemenea, că au fost prezente semnificativ mai puține bacterii în rănile tratate cu pansamentele cu argint, deși acest lucru a fost mai pronunțat cu pansamentul cu sare de Ag oxigenată și pansamentul Ag1+ + EDTA/BC comparativ cu pansamentul Ag1+. Aceste date arată că pansamentele cu argint testate au avut grade diferite de impact asupra structurii biofilmului, dar niciunul dintre pansamentele cu argint nu a reușit să eradicheze biofilmul, ceea ce susține necesitatea unei abordări holistice a tratamentului infecțiilor cu biofilm din plăgi; utilizarea de benzi de braț din argint. Tratamentul este precedat de debridare fizică pentru a îndepărta cea mai mare parte a biofilmului.
Plăgile cronice se află adesea într-o stare de inflamație severă, cu un exces de celule inflamatorii care rămân în țesutul plăgii pentru o perioadă lungă de timp, provocând leziuni tisulare și epuizând oxigenul necesar pentru metabolismul celular eficient și funcția din rană26. Biofilmele exacerbează acest mediu ostil al plăgii prin afectarea negativă a vindecării într-o varietate de moduri, inclusiv inhibarea proliferării și migrării celulare și activarea citokinelor proinflamatorii27. Pe măsură ce pansamentele cu argint devin mai eficiente, este important să înțelegem impactul pe care îl au asupra mediului plăgii și a vindecării.
Interesant este că, deși toate pansamentele cu argint au afectat compoziția biofilmului, doar pansamentele cu sare de argint oxigenată au crescut reepitelizarea acestor răni infectate. Aceste date susțin descoperirile noastre anterioare17 și pe cele ale lui Kalan și colab. (2017)28, care au demonstrat profiluri bune de siguranță și toxicitate ale sărurilor de argint oxigenate, deoarece concentrațiile mai mici de argint au fost eficiente împotriva biofilmelor.
Studiul nostru actual evidențiază diferențele dintre tehnologia cu argint a pansamentelor antimicrobiene și impactul acestei tehnologii asupra mediului plăgii și vindecării independente de infecție. Cu toate acestea, aceste rezultate diferă de studiile anterioare care au arătat că pansamentul Ag1+ + EDTA/BC a îmbunătățit parametrii de vindecare a urechilor de iepure rănite in vivo. Totuși, acest lucru se poate datora diferențelor dintre modelele animale, timpii de măsurare și metodele de aplicare bacteriană29. În acest caz, măsurătorile plăgii au fost efectuate la 12 zile după leziune pentru a permite ingredientelor active ale pansamentului să acționeze asupra biofilmului pe o perioadă mai lungă de timp. Acest lucru este susținut de un studiu care a arătat că ulcerele de picior infectate clinic tratate cu Ag1+ + EDTA/BC au crescut inițial în dimensiune după o săptămână de tratament, iar apoi în următoarele 3 săptămâni de tratament cu Ag1+ + EDTA/BC și în decurs de 4 săptămâni de la utilizarea medicamentelor non-antimicrobiene. Pansamente CMC pentru reducerea dimensiunii ulcerelor30.
Anumite forme și concentrații de argint s-au dovedit anterior a fi citotoxice in vitro 11, însă aceste rezultate in vitro nu se traduc întotdeauna în efecte adverse in vivo. În plus, progresele în tehnologia argintului și o mai bună înțelegere a compușilor și concentrațiilor de argint din pansamente au condus la dezvoltarea a numeroase pansamente cu argint sigure și eficiente. Cu toate acestea, pe măsură ce tehnologia pansamentelor cu argint avansează, este important să se înțeleagă impactul acestor pansamente asupra mediului plăgii 31,32,33. Anterior s-a raportat că rata crescută de reepitelizare corespunde unei proporții crescute de macrofage M2 antiinflamatorii în comparație cu fenotipul M1 proinflamator. Acest lucru a fost observat într-un model anterior de șoarece, în care pansamentele pentru răni cu hidrogel de argint au fost comparate cu sulfadiazină de argint și hidrogeluri non-antimicrobiene 34.
Plăgile cronice pot prezenta inflamație excesivă și s-a observat că prezența excesului de neutrofile poate fi dăunătoare vindecării rănilor35. Într-un studiu efectuat pe șoareci cu deficit de neutrofile, prezența neutrofilelor a întârziat reepitelizarea. Prezența excesului de neutrofile duce la niveluri ridicate de proteaze și specii reactive de oxigen, cum ar fi superoxidul și peroxidul de hidrogen, care sunt asociate cu răni cronice și cu vindecare lentă37,38. De asemenea, o creștere a numărului de macrofage, dacă nu este controlată, poate duce la întârzierea vindecării rănilor39. Această creștere este deosebit de importantă dacă macrofagele nu sunt capabile să treacă de la un fenotip pro-inflamator la un fenotip pro-vindecare, ceea ce duce la faptul că rănile nu reușesc să iasă din faza inflamatorie de vindecare40. Am observat o scădere a neutrofilelor și macrofagelor în rănile infectate cu biofilm după 3 zile de tratament cu pansamente integrale cu argint, dar scăderea a fost mai pronunțată cu pansamentele cu sare oxigenată. Această scădere poate fi un rezultat direct al răspunsului imun la argint, al unui răspuns la scăderea încărcăturii microbiene sau al faptului că rana se află într-un stadiu avansat de vindecare și, prin urmare, celulele imune din rană sunt reduse. Reducerea numărului de celule inflamatorii din rană poate menține un mediu propice vindecării rănilor. Mecanismul de acțiune al modului în care sărurile oxi de Ag promovează vindecarea independentă de infecție este neclar, dar capacitatea sărurilor oxi de Ag de a produce oxigen și de a distruge nivelurile dăunătoare de peroxid de hidrogen, un mediator al inflamației, ar putea explica acest lucru și necesită studii suplimentare17.
Plăgile infectate cronice care nu se vindecă reprezintă o problemă atât pentru medici, cât și pentru pacienți. Deși multe pansamente pretind că sunt antimicrobiene, cercetările se concentrează rareori pe alți factori cheie care influențează micromediul plăgii. Acest studiu arată că diferite tehnologii cu argint au o eficacitate antimicrobiană diferită și, important, efecte diferite asupra mediului plăgii și a vindecării, independent de infecție. Deși aceste studii in vitro și in vivo demonstrează eficacitatea acestor pansamente în tratarea infecțiilor plăgilor și promovarea vindecării, sunt necesare studii clinice randomizate controlate pentru a evalua eficacitatea acestor pansamente în clinică.
Seturile de date utilizate și/sau analizate în cadrul studiului actual sunt disponibile de la autorul corespondent, la cerere rezonabilă.
Data publicării: 15 iulie 2024