Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport CSS limitat. Pentru cele mai bune rezultate, vă recomandăm să utilizați o versiune mai nouă a browserului dvs. (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a ne asigura că un suport continuu, afișăm site -ul fără styling sau JavaScript.
Creșterea microbiană a rănilor se manifestă adesea ca biofilme, care interferează cu vindecarea și sunt dificil de eradicat. Noile pansamente de argint susțin că combate infecțiile rănilor, dar eficacitatea lor de antibiofilm și efectele de vindecare independente de infecție sunt în general necunoscute. Folosind modele de biofilm in vitro și in vivo de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa, raportăm eficacitatea pansamentelor generatoare de ioni Ag1+; Ag1+ pansamente care conțin acid etilenediaminetetraacetic și clorură de benzetoniu (Ag1+/EDTA/BC) și pansamente care conțin azotat de argint (Ag Oxysalts). , care produc ioni Ag1+, Ag2+ și Ag3+ pentru a combate biofilmul plăgii și efectul acesteia asupra vindecării. Pantela Ag1+ au avut efecte minime asupra biofilmului plăgii in vitro și la șoareci (C57BL/6J). În schimb, sărurile Ag oxigenate și pansamentele Ag1+/EDTA/BC au redus semnificativ numărul de bacterii viabile în biofilme in vitro și au demonstrat o reducere semnificativă a componentelor bacteriene și EPS în biofilmele rănilor de șoarece. Aceste pansamente au avut efecte diferite asupra vindecării rănilor infectate cu biofilm și non-biofilm, cu pansamente cu sare oxigenate având efecte mai benefice asupra reepitelializării, dimensiunii plăgii și inflamației în comparație cu tratamentele de control și alte pansamente de argint. Diferitele proprietăți fizico-chimice ale pansamentelor de argint pot avea efecte diferite asupra biofilmului și vindecării rănilor, iar acest lucru ar trebui luat în considerare atunci când selectați un pansament pentru tratamentul rănilor infectate cu biofilm.
Rănile cronice sunt definite ca „răni care nu reușesc să progreseze prin etapele normale ale vindecării într -un mod ordonat și la timp” 1. Rănile cronice creează o povară psihologică, socială și economică pentru pacienți și sistemul de asistență medicală. Cheltuielile anuale ale NHS pentru tratarea rănilor și comorbidităților asociate sunt estimate la 8,3 miliarde de lire sterline în 2017-182. Rănile cronice sunt, de asemenea, în prezent o problemă presantă în Statele Unite, Medicare estimând costul anual al tratării pacienților cu răni la 28,1 și 96,8 miliarde USD.
Infecția este un factor major care împiedică vindecarea rănilor. Infecțiile se manifestă adesea ca biofilme, care sunt prezente în 78% din rănile cronice care nu se vindecă. Biofilmele se formează atunci când microorganismele devin atașate ireversibil de suprafețe, cum ar fi suprafețele plăgii și pot agrega pentru a forma comunități producătoare de polimer extracelular (EPS). Biofilmul plăgii este asociat cu un răspuns inflamator crescut care duce la deteriorarea țesuturilor, care poate întârzia sau preveni vindecarea4. Creșterea leziunilor țesuturilor se poate datora în parte activității crescute a metaloproteinazelor matriceale, colagenazei, elastazei și speciilor de oxigen reactiv5. Mai mult decât atât, celulele inflamatorii și biofilmele sunt ele însele consumatori mari de oxigen și, prin urmare, pot provoca hipoxie țesutului local, epuizând celulele oxigenului vital necesar pentru repararea eficientă a țesuturilor6.
Biofilmele mature sunt foarte rezistente la agenții antimicrobieni, necesitând strategii agresive pentru controlul infecțiilor cu biofilm, cum ar fi tratamentul mecanic urmat de un tratament antimicrobian eficient. Deoarece biofilmele se pot regenera rapid, antimicrobiene eficiente pot reduce riscul de reformare după debridare chirurgicală7.
Argintul este utilizat din ce în ce mai mult în pansamentele antimicrobiene și este adesea utilizat ca tratament de primă linie pentru rănile infectate cronice. Există multe pansamente de argint disponibile în comerț, fiecare conținând o compoziție de argint diferită, concentrație și matrice de bază. Progresele în brațele de argint au dus la dezvoltarea de noi brațe de argint. Forma metalică de argint (Ag0) este inertă; Pentru a obține o eficiență antimicrobiană, trebuie să piardă un electron pentru a forma argint ionic (Ag1+). Pansamentele tradiționale de argint conțin compuși argintii sau argint metalic care, atunci când sunt expuși la lichid, se descompun pentru a forma ioni Ag1+. Acești ioni Ag1+ reacționează cu celula bacteriană, eliminând electronii din componente structurale sau procese critice necesare supraviețuirii. Tehnologia brevetată a dus la dezvoltarea unui nou compus de argint, AG Oxysalts (nitrat de argint, AG7NO11), care este inclus în pansamentele cu răni. Spre deosebire de argintul tradițional, descompunerea sărurilor care conțin oxigen produce stări de argint cu valență mai mare (Ag1+, Ag2+și Ag3+). Studiile in vitro au arătat că concentrațiile scăzute de săruri de argint oxigenate sunt mai eficiente decât argintul cu un singur ion (Ag1+) împotriva bacteriilor patogene, cum ar fi Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus și Escherichia coli8,9. Un alt tip nou de pansament de argint include ingrediente suplimentare, și anume acidul etilenediaminetetraacetic (EDTA) și clorura de benzetoniu (BC), despre care se raportează că vizează EPS biofilm și cresc astfel penetrarea argintului în biofilm. Aceste noi tehnologii de argint oferă noi modalități de a viza biofilmele rănilor. Cu toate acestea, impactul acestor antimicrobiene asupra mediului plăgii și vindecării independente de infecție este important pentru a se asigura că nu creează un mediu nefavorabil sau întârzie vindecarea. Au fost raportate îngrijorări cu privire la citotoxicitatea de argint in vitro cu mai multe pansamente de argint 10,11. Cu toate acestea, citotoxicitatea in vitro nu s -a tradus încă în toxicitate in vivo, iar mai multe pansamente Ag1+ au demonstrat un profil de siguranță bun12.
Aici, am investigat eficacitatea pansamentelor carboximetilceluloze care conțin formulări noi de argint împotriva biofilmului plăgii in vitro și in vivo. În plus, au fost evaluate efectele acestor pansamente asupra răspunsurilor imune și vindecării independente de infecție.
Toate pansamentele utilizate au fost disponibile comercial. Pansamentul de fibre cu gel Kerracel 3M (3M, Knutsford, Marea Britanie) este un pansament de fibre de gel 100% non-antimicrobiene 100%, care a fost utilizat ca pansament de control în acest studiu. Au fost evaluate trei pansamente antimicrobiene de argint CMC, și anume 3M Kerracel Ag Pansament (3M, Knutsford, Marea Britanie), care conține 1,7%în greutate. Sare de argint oxigenat (Ag7NO11) în ioni de argint cu valență mai mare (Ag1+, Ag2+și Ag3+). În timpul descompunerii Ag7NO11, Ag1+, Ag2+ și Ag3+ se formează într -un raport de 1: 2: 4. Pansament Aquacel AG Extra care conține 1,2% clorură de argint (Ag1+) (Convatec, Deeside, Marea Britanie) 13 și Aquacel Ag+pansament suplimentar care conține 1,2% clorură de argint (Ag1+), EDTA și clorură de benzetoniu (Convatec, Deeside, Marea Britanie) 14.
Tulpinile utilizate în acest studiu au fost Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) și Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bacteriile au fost cultivate peste noapte în bulionul Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Marea Britanie). Cultura peste noapte a fost apoi diluată 1: 100 în bulionul Mueller-Hinton și 200 ul placat pe membrane sterile de 0,2 µm Whatman Cyclopore (Whatman plc, Maidstone, Marea Britanie) pe plăcile de agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Marea Britanie, Britain ). ) Formarea biofilmului colonial la 37 ° C timp de 24 de ore. Aceste biofilme coloniale au fost testate pentru contracție logaritmică.
Tăiați pansamentul în 3 cm2 bucăți pătrate și pre-umentin cu apă deionizată sterilă. Puneți bandajul peste biofilmul coloniei pe placa de agar. Fiecare 24 de ha de biofilm a fost îndepărtat, iar bacteriile viabile din biofilm (CFU/ML) au fost cuantificate prin diluare în serie (10–1 până la 10-7) în bulionul de neutralizare a unghiului de zi (Merck-Milipore). După 24 de ore de incubare la 37 ° C, s-au efectuat numărul de plăci standard pe plăcile de agar Mueller-Hinton. Fiecare tratament și punct de timp a fost efectuat în trei exemplare, iar numărul de plăci au fost repetate pentru fiecare diluare.
Pielea din burtă de porc este obținută de la porci albi mari de sex feminin în 15 minute de la sacrificare în conformitate cu standardele de export a Uniunii Europene. Pielea a fost bărbierită și curățată cu șervețele de alcool, apoi înghețată la -80 ° C timp de 24 de ore pentru a devitaliza pielea. După decongelare, 1 cm2 bucăți de piele au fost spălate de trei ori cu PBS, 0,6% hipoclorit de sodiu și 70% etanol timp de 20 de minute de fiecare dată. Înainte de a îndepărta epiderma, îndepărtați orice etanol rămas spălat de 3 ori în PBS steril. The skin was cultured in a 6-well plate with a 0.45-μm-thick nylon membrane (Merck-Millipore) on top and 3 absorbent pads (Merck-Millipore) containing 3 ml fetal bovine serum (Sigma) supplemented with 10% Dulbecco's modified Vultur. Mediu (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Aldrich Ltd.).
Biofilmele coloniale au fost cultivate așa cum este descris pentru studiile de expunere la biofilm. După ce a cultivat biofilmul pe membrană timp de 72 de ore, biofilmul a fost aplicat pe suprafața pielii folosind o buclă de inoculare sterilă și membrana a fost îndepărtată. Biofilmul a fost apoi incubat pe dermul porcului pentru încă 24 de ore la 37 ° C pentru a permite biofilmului să se maturizeze și să adere la pielea porcului. După ce biofilmul s-a maturizat și a fost atașat, un pansament de 1,5 cm2, pre-umezit cu apă distilată sterilă, a fost aplicat direct pe suprafața pielii și incubat la 37 ° C timp de 24 de ore. Bacteriile viabile au fost vizualizate prin colorarea prin aplicarea uniformă a reactivului de viabilitate a celulelor prestoblue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Marea Britanie) pe suprafața apicală a fiecărei explanturi și incubarea acesteia timp de 5 minute. Utilizați camera digitală Leica DFC425 pentru a capta instantaneu imagini la microscopul Leica MZ8. Zonele colorate roz au fost cuantificate folosind Image Pro Software versiunea 10 (Media CyberNetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). Microscopia electronică de scanare a fost efectuată așa cum este descris mai jos.
Bacteriile crescute peste noapte au fost diluate 1: 100 în bulionul Mueller-Hinton. Au fost adăugate 200 µl de cultură la membrana sterilă de 0,2 μm Whatman Cyclopore (Whatman, Maidstone, Marea Britanie) și placate pe agar Mueller-Hinton. Plăcile de biofilm au fost incubate la 37 ° C timp de 72 de ore pentru a permite formarea de biofilm matură.
După 3 zile de maturare a biofilmului, un bandaj pătrat de 3 cm2 a fost plasat direct pe biofilm și incubat la 37 ° C timp de 24 de ore. După îndepărtarea bandajului de pe suprafața biofilmului, a fost adăugat la suprafața fiecărui biofilm 1 ml 1 ml de reactiv de viabilitate celulară prestoblue (Invitrogen, Waltham, MA). Suprafețele au fost uscate înainte de înregistrarea schimbărilor de culoare folosind o cameră digitală Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Marea Britanie).
Pregătiți culturi peste noapte pe agar Mueller-Hinton, transferați colonii individuale la 10 ml bulion Mueller-Hinton și incubați pe un agitator la 37 ° C (100 rpm). După incubarea peste noapte, cultura a fost diluată 1: 100 în bulionul Mueller-Hinton și 300 pL a fost observat pe membrana Cyclopore Cyman de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Marea Britanie) pe Mueller-Hinton Agar și incubată la 37 ° C în 72 de ore în 72 de ore . . Biofilmul matur a fost aplicat pe rană, așa cum este descris mai jos.
Toate lucrările cu animale au fost efectuate la Universitatea din Manchester sub o licență de proiect aprobată de Oficiul pentru Asistența Animalelor și Revizuirea Etică (P8721BD27) și în conformitate cu orientările publicate de Oficiul de acasă în 2012 revizuit ASPA. Toți autorii au respectat orientările de sosire. Șoarecii C57BL/6J vechi de opt săptămâni (Envigo, Oxon, Marea Britanie) au fost folosiți pentru toate studiile in vivo. Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Marea Britanie) și suprafețele lor dorsale au fost bărbierit și curățat. Fiecare mouse a primit apoi o rană excizională de 2 × 6 mm folosind un pumn de biopsie Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Marea Britanie). Pentru rănile infectate cu biofilm, aplicați biofilm colonial de 72 de ore cultivate pe membrană, așa cum este descris mai sus, pe stratul dermic al plăgii folosind o buclă de inoculare sterilă imediat după accidentare și aruncați membrana. Un centimetru pătrat de pansament este în prealabil cu apă sterilă pentru a menține un mediu umed de rană. Pansamentele au fost aplicate direct pe fiecare rană și acoperite cu un film tegaderm de 3 m (3M, Bracknell, Marea Britanie) și adeziv lichid cu mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicate în jurul marginilor pentru a oferi aderență suplimentară. Buprenorfina (Animalcare, York, Marea Britanie) a fost administrată la o concentrație de 0,1 mg/kg ca analgezic. Șoareci Cull la trei zile după accidentare folosind metoda Schedule 1 și îndepărtați, la jumătate și depozitați zona plăgii, după cum este necesar.
S -a efectuat colorarea hematoxilinei (termofisher științific) și eosină (termofisher științific) conform protocolului producătorului. Zona de răni și reepitelializarea au fost cuantificate folosind Image Pro Software versiunea 10 (Media CyberNetics Inc, Rockville, MD).
Secțiunile de țesut au fost depuse în xilen (Thermofisher Scientific, Loughborough, Marea Britanie), rehidratate cu etanol gradat cu 100-50% și cufundat pe scurt în apă deionizată (Thermofisher Scientific). Imunohistochimia a fost efectuată folosind kitul Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), conform protocolului producătorului. Anticorpii primari la neutrofile NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) și macrofage MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Marea Britanie) au fost diluate 1: 100 în soluția de blocare și adăugate la suprafața tăiată, urmată de 2 anticorpi anti-, Vectastain Kit de substrat ABC și Vector Nova Red Peroxidază (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) și contracarate cu hematoxilină. Imaginile au fost achiziționate folosind un microscop Olympus BX43 și o cameră digitală Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Marea Britanie).
Probele de piele au fost fixate în 2,5% glutaraldehidă și 4% formaldehidă în 0,1 M HEPES (pH 7,4) timp de 24 de ore la 4 ° C. Probele au fost deshidratate folosind etanol gradat și uscate în CO2 folosind un uscător cu puncte critice Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Marea Britanie) și sputter acoperit cu aliaj de aur-Palladium folosind un sistem Quorum SC7620 Mini Sputter/System de descărcare. Exemplarele au fost imaginate folosind un microscop electronic de scanare FEI Quanta 250 (Thermofisher Scientific) pentru a vizualiza punctul central al plăgii.
TOTO-1 iodură (2 μm) a fost aplicată pe suprafața rarii de șoarece excizate și incubată timp de 5 min la 37 ° C (Thermofisher Scientific) și tratată cu SYTO-60 (10 μM) la 37 ° C (Thermofisher Scientific). Au fost create imagini de 15 minute cu stivă Z folosind un Leica TCS SP8.
Datele de replicare biologică și tehnică au fost tabulate și analizate folosind software -ul GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Analiza unidirecțională a variației cu comparații multiple folosind testul post-hoc al lui Dunnett a fost utilizată pentru a testa diferențele dintre fiecare tratament și pansamentul de control non-antimicrobian. O valoare P <0,05 a fost considerată semnificativă.
Eficacitatea pansamentelor fibroase cu gel de argint a fost evaluată pentru prima dată împotriva coloniilor de biofilm de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa in vitro. Pansamentele de argint conțin diferite formule de argint: pansamentele tradiționale de argint produc ioni Ag1+; Pansamentele de argint, care pot produce ioni Ag1+ după adăugarea de EDTA/BC, pot distruge matricea biofilmului și pot expune bacteriile la argint sub efectul antibacterian al argintului. ioni15 și pansamente care conțin săruri Ag oxigenate care produc ioni Ag1+, Ag2+ și Ag3+. Eficacitatea sa a fost comparată cu un pansament de control non-antimicrobian realizat din fibre gelate. Restul de bacterii viabile în biofilm au fost evaluate la fiecare 24 de ore timp de 8 zile (Figura 1). În ziua 5, biofilmul a fost reinoculat cu 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus sau 1,22 × 105p. aeruginosa pentru a evalua recuperarea biofilmului. În comparație cu pansamentele de control non-antimicrobiene, pansamentele Ag1+ au avut un efect minim asupra viabilității bacteriene în biofilmele Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa pe parcursul a 5 zile. În schimb, pansamentele care conțin săruri oxigenate Ag și Ag1 + + EDTA/BC au fost eficiente în uciderea bacteriilor în biofilm în termen de 5 zile. După inocularea repetată cu bacterii planctonice în ziua 5, nu s -a observat nicio restaurare a biofilmului (Fig. 1).
Cuantificarea bacteriilor viabile în biofilmele Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa după tratamentul cu pansamente de argint. Coloniile de biofilm de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa au fost tratate cu pansamente de argint sau pansamente de control non-antimicrobiene, iar numărul de bacterii viabile rămase a fost determinat la fiecare 24 de ore. După 5 zile, biofilmul a fost reinoculat cu 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus sau 1,22 × 105p. Coloniile bacterioplanctonului Pseudomonas aeruginosa au fost formate individual pentru a evalua recuperarea biofilmului. Graficele arată o eroare medie +/- standard.
Pentru a vizualiza efectul pansamentelor de argint asupra viabilității biofilmului, pansamentele au fost aplicate la biofilme mature cultivate pe pielea porcină ex vivo. După 24 de ore, pansamentul este îndepărtat și biofilmul este colorat cu un colorant reactiv albastru, care este metabolizat de bacteriile vii la o culoare roz. Biofilmele tratate cu pansamente de control au fost roz, ceea ce indică prezența bacteriilor viabile în biofilm (Figura 2A). În schimb, biofilmul tratat cu pansamentul Ag Oxysols a fost în primul rând albastru, ceea ce indică faptul că bacteriile rămase de pe suprafața pielii porcului erau bacterii nonviabile (Figura 2B). Colorația mixtă albastră și roz a fost observată în biofilme tratate cu pansamente care conțin Ag1+, ceea ce indică prezența unor bacterii viabile și non-viabile în biofilm (Figura 2C), în timp ce pansamentele EDTA/BC care conțin Ag1+ au fost predominant albastru cu unele pete roz. indicând zonele care nu sunt afectate de pansamentul de argint (figura 2D). Cuantificarea zonelor active (roz) și inactive (albastru) a arătat că plasturele de control a fost de 75% activ (Figura 2E). Pantamentele Ag1 + + EDTA/BC au efectuat în mod similar pansamentele cu sare Ag oxigenate, cu rate de supraviețuire de 13% și, respectiv, 14%. Pansamentul Ag1+ a redus, de asemenea, viabilitatea bacteriană cu 21%. Aceste biofilme au fost apoi observate folosind microscopie electronică de scanare (SEM). După tratamentul cu pansamentul de control și pansamentul Ag1+, s -a observat un strat de Pseudomonas aeruginosa care acoperă pielea porcină (Figura 2F, H), în timp ce după tratamentul cu pansamentul Ag1+, au fost găsite puține celule bacteriene și au fost găsite puține celule bacteriene dedesubt. Fibrele de colagen pot fi considerate ca structura țesutului pielii porcine (Figura 2G). După tratamentul cu pansament Ag1 + + EDTA/BC, plăcile bacteriene și plăcile cu fibre de colagen subiacente au fost vizibile (Figura 2I).
Vizualizarea biofilmului Pseudomonas aeruginosa după tratamentul pansamentului de argint. (A-D) Viabilitatea bacteriană în biofilmele pseudomonas aeruginosa cultivate pe pielea porcin a fost vizualizată folosind vopsea de viabilitate prestoblue la 24 de ore după tratamentul cu pansamente de argint sau pansamente de control non-antimicrobiene. Bacteriile vii sunt roz, bacterii non-viabile, iar pielea de porc sunt albastre. (E) Cuantificarea biofilmelor pseudomonas aeruginosa cultivate pe pielea porcină (punct roz) folosind microscopie electronică de scanare Image Pro versiunea 10 (FI) și tratată cu un pansament de argint sau un pansament de control non-antimicrobian timp de 24 de ore. Bara de scară SEM = 5 µm. (J - M) Biofilmele coloniale au crescut pe filtre și au fost colorate cu colorant reactiv Prestoblue după 24 de ore de incubare cu pansamente de argint.
Pentru a determina dacă un contact strâns între pansamente și biofilme a afectat eficacitatea pansamentelor, biofilmele coloniale așezate pe o suprafață plană au fost tratate cu pansamentele timp de 24 de ore și apoi colorate cu coloranți reactivi. Biofilmul netratat avea o culoare roz închis (figura 2J). Spre deosebire de biofilmele tratate cu pansamente care conțin săruri Ag oxigenate (Figura 2K), biofilmele tratate cu pansamente care conțin Ag1+ sau Ag1++ EDTA/BC au prezentat benzi de colorare roz (Figura 2L, M). Această colorație roz indică prezența bacteriilor viabile și este asociată cu zona de sutură din interiorul pansamentului. Aceste zone cusute creează spații moarte care permit supraviețuirii bacteriilor din biofilm.
Pentru a evalua eficacitatea pansamentelor de argint in vivo, rănile excizate cu grosime completă a șoarecilor infectați cu S. aureus matur și biofilmele P. aeruginosa au fost tratate cu pansamente de control nonantimicrobiene sau pansamente de argint. După 3 zile de tratament, analiza imaginii macroscopice a arătat dimensiuni mai mici ale plăgii atunci când a fost tratată cu pansamente de sare oxigenate în comparație cu pansamentele de control non-antimicrobiene și alte pansamente de argint (Figura 3A-H). Pentru a confirma aceste observații, rănile au fost recoltate și zona de răni și reepitelializarea au fost cuantificate pe hematoxilină și secțiuni de țesut colorate cu eosină folosind Image Pro Software versiunea 10 (Figura 3I-L).
Efectul pansamentelor de argint pe suprafața plăgii și re-epitelializarea rănilor infectate cu biofilme. (A - H) Celule mici infectate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa (A - D) și Staphylococcus aureus (E - H) după trei zile de tratament cu un pansament de control nonantimicrobian, un pansament cu sare Ag oxigenat, un pansament Ag1+ și un Ag1+ pansament. Imagini macroscopice reprezentative. Rănile șoarecilor cu pansament Ag1 + + EDTA/BC. (IL) Infecția reprezentativă Pseudomonas aeruginosa, secțiuni histologice colorate cu hematoxilină și eozină, utilizate pentru a cuantifica suprafața plăgii și regenerarea epitelială. Cuantificarea suprafeței plăgii (M, O) și a reepitelializării procentuale (N, P) a rănilor infectate cu biofilmele Pseudomonas aeruginosa (M, N) și Staphylococcus aureus (O, P) (pe grupul de tratament n = 12). Graficele arată o eroare medie +/- standard. * înseamnă p = <0,05 ** înseamnă p = <0,01; Scară macroscopică = 2,5 mm, scară histologică = 500 µm.
Cuantificarea zonei rănilor în rănile infectate cu biofilm Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) a arătat că rănile tratate cu oxysalts Ag au o dimensiune medie a plăgii de 2,5 mm2, în timp ce pansamentul de control non-antimicrobian a avut o dimensiune medie adevărat. a atins semnificație statistică (figura 3M). P = 0,423). Rănile tratate cu Ag1+ sau Ag1++ EDTA/BC nu au prezentat nicio reducere a zonei plăgii (3,1 mm2 și, respectiv, 3,6 mm2). Tratamentul cu pansament cu sare Ag oxigenat a promovat reepitelializarea într-o măsură mai mare decât pansamentul de control non-antimicrobian (34% și, respectiv, 15%; P = 0,029) și Ag1+ sau Ag1++ EDTA/BC (10% și 11%) ( Figura 3N). . , respectiv).
Tendințe similare în zona plăgii și regenerarea epitelială au fost observate la rănile infectate cu biofilme S. aureus (Figura 3O). Pansamentele care conțin săruri de argint oxigenate au redus suprafața plăgii (2,0 mm2) cu 23% în comparație cu pansamentul de control non-antimicrobian (2,6 mm2), deși această reducere nu a fost semnificativă (p = 0,304) (Fig. 3O). În plus, zona plăgii din grupul de tratament Ag1+ a fost ușor redusă (2,4 mm2), în timp ce rana tratată cu pansament Ag1++ EDTA/BC nu a redus suprafața plăgii (2,9 mm2). Sărurile de oxigen ale Ag au promovat, de asemenea, reepitelializarea rănilor infectate cu Biofilm S. aureus (31%) într-o măsură mai mare decât cele tratate cu pansamente de control non-antimicrobiene (12%, p = 0,003) (Figura 3p). Pansamentul Ag1+ (16%, p = 0,903) și pansamentul Ag+ 1+ EDTA/BC (14%, p = 0,965) au arătat niveluri de regenerare epitelială similară controlului.
Pentru a vizualiza efectul pansamentelor de argint pe matricea biofilmului, a fost efectuată colorarea iodurii TOTO 1 și SYTO 60 (Fig. 4). TOTO 1 Iodură este un colorant impermeabil celular care poate fi utilizat pentru a vizualiza cu exactitate acizii nucleici extracelulari, care sunt abundenți în EPS de biofilme. SYTO 60 este un colorant permeabil celular folosit ca contorSterstain16. Observațiile iodurii TOTO 1 și SYTO 60 la rănile inoculate cu biofilme de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) și Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) au arătat că, după 3 zile de tratament pentru pansament, EPS în biofilm a fost semnificativ redus. care conține săruri oxigenate Ag și Ag1 + + EDTA/BC. Ag1+ pansamente fără componente suplimentare de antibiofilm au redus semnificativ ADN-ul fără celule în rănile inoculate cu Pseudomonas aeruginosa, dar au fost mai puțin eficiente în rănile inoculate cu Staphylococcus aureus.
Imagistica in vivo a biofilmului plăgii după 3 zile de tratament cu pansamente de control sau argint. Imagini confocale ale Pseudomonas aeruginosa (A - D) și Staphylococcus aureus (I - L) colorate cu Toto 1 (verde) pentru a vizualiza acizii nucleici extracelulați, o componentă a polimerilor biofilm extracelulari. Pentru a colora acizii nucleici intracelulari, utilizați Syto 60 (roșu). acizi. P. Microscopie electronică de scanare a rănilor infectate cu biofilme Pseudomonas aeruginosa (E - H) și Staphylococcus aureus (M - P) după 3 zile de tratament cu pansamente de control și argint. Bara de scară SEM = 5 µm. Bara de scară imagistică confocală = 50 µm.
Microscopia electronică de scanare a arătat că șoarecii inoculați cu colonii de biofilm de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) și Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) au avut semnificativ mai puține bacterii în rănile lor după 3 zile de tratament cu toate pansamentele de argint.
Pentru a evalua efectul pansamentelor de argint asupra inflamației rănilor la șoarecii infectați cu biofilm, secțiunile de răni infectate cu biofilm tratate cu pansamente de control sau argint timp de 3 zile au fost colorate imunohistochimice folosind anticorpi specifici pentru neutrofile și macrofage. Determinarea cantitativă a neutrofilelor și macrofagelor intern. țesut de granulare. Figura 5). Toate pansamentele de argint au redus numărul de neutrofile și macrofage în rănile infectate cu Pseudomonas aeruginosa în comparație cu pansamentele de control non-antimicrobiene după trei zile de tratament. Cu toate acestea, tratamentul cu pansamentul cu sare de argint oxigenat a dus la o reducere mai mare a neutrofilelor (p = <0,0001) și a macrofagelor (p = <0,0001) în comparație cu alte pansamente de argint testate (Figura 5I, J). Deși Ag1++ EDTA/BC a avut un efect mai mare asupra biofilmului plăgii, a redus nivelul de neutrofil și macrofag într -o măsură mai mică decât pansamentul Ag1+. Au fost observate de asemenea răni moderate infectate cu biofilm S. aureus după îmbrăcarea cu Ag (P = <0,0001), Ag1+ (P = 0,0008) și Ag1 ++ EDTA/BC (P = 0,0043) oxisoli în comparație cu control. Tendințe similare sunt observate pentru neutropenie. bandaj (Fig. 5K). Cu toate acestea, doar pansamentul cu sare Ag oxigenat a arătat o reducere semnificativă a numărului de macrofage în țesutul de granulare în comparație cu controlul rănilor infectate cu biofilme S. aureus (p = 0.0339) (Figura 5L).
Neutrofilele și macrofagele au fost cuantificate în rănile infectate cu biofilme Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus după 3 zile de tratament cu control non-antimicrobian sau pansamente de argint. Neutrofilele (AD) și macrofagele (EH) au fost cuantificate în secțiuni de țesut colorate cu anticorpi specifici pentru neutrofile sau macrofage. Cuantificarea neutrofilelor (I și K) și a macrofagelor (J și L) în rănile infectate cu biofilme Pseudomonas aeruginosa (I și J) și Staphylococcus aureus (K&L). N = 12 pe grup. Graficele arată media +/- eroare standard, valori de semnificație în comparație cu pansamentul de control non-antibacterian, * înseamnă p = <0.05, ** înseamnă p = <0.01; *** înseamnă p = <0,001; Indică P = <0,0001).
Am evaluat apoi efectul pansamentelor de argint asupra vindecării independente de infecție. Rănile excizionale neinfectate au fost tratate cu un pansament de control non-antimicrobian sau un pansament de argint timp de 3 zile (figura 6). Printre pansamentele de argint testate, numai rănile tratate cu pansamentul de sare oxigenat au apărut mai mici pe imagini macroscopice decât rănile tratate cu controlul (Figura 6A-D). Cuantificarea suprafeței plăgii folosind analiza histologică a arătat că suprafața medie a plăgii după tratamentul cu pansamentul Ag Oxysols a fost de 2,35 mm2 comparativ cu 2,96 mm2 pentru rănile tratate cu grupul de control, dar această diferență nu a atins o semnificație statistică (p = 0,488) (Fig. . În schimb, nu a fost observată nicio reducere a zonei plăgii după tratamentul cu Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) sau Ag1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) în comparație cu grupul de control. Regenerarea epitelială crescută a fost observată cu pansamentul Ag Oxysol în comparație cu grupul de control (30% vs. 22%, respectiv), deși acest lucru nu a atins o semnificație (p = 0,067), acest lucru este destul de semnificativ și confirmă rezultatele anterioare. Un pansament cu oxysols promovează reepitelializarea. -Epitelizarea rănilor neinfectate17. În schimb, tratamentul cu pansamente Ag1+ sau Ag1++ EDTA/BC nu a avut niciun efect sau a prezentat o scădere a reepitelializării în comparație cu controlul.
Efectul pansamentului de răni de argint asupra vindecării rănilor la șoarecii neinfectați cu rezecție completă. (AD) Imagini macroscopice reprezentative ale rănilor după trei zile de tratament cu un pansament de control non-antimicrobian și un pansament de argint. (EH) Secțiuni de răni reprezentative colorate cu hematoxilină și eozină. Cuantificarea suprafeței plăgii (I) și procentul de reepitelializare (J) au fost calculate din secțiuni histologice la punctul mediu al plăgii folosind software -ul de analiză a imaginilor (n = 11–12 pe grup de tratament). Graficele arată o eroare medie +/- standard. * înseamnă p = <0.05.
Argintul are o istorie lungă de utilizare ca terapie antimicrobiană în vindecarea rănilor, dar numeroasele formulări și metode de livrare diferite pot duce la diferențe de eficacitate antimicrobiană 18. Mai mult, proprietățile antibiofilm ale sistemelor specifice de livrare a argintului nu sunt pe deplin înțelese. Deși răspunsul imun al gazdei este relativ eficient împotriva bacteriilor planctonice, în general este mai puțin eficient împotriva biofilmelor19. Bacteriile planctonice sunt ușor fagocitate de macrofage, dar în cadrul biofilmelor, celulele agregate prezintă probleme suplimentare prin limitarea răspunsului gazdă în măsura în care celulele imune pot suferi apoptoză și eliberează factori proinflamatori pentru a îmbunătăți răspunsul imun20. S -a observat că unele leucocite pot pătrunde în biofilms21, dar nu sunt în măsură să fagocitoze bacteriile odată ce această apărare este compromisă22. O abordare holistică ar trebui să fie utilizată pentru a sprijini răspunsul imun al gazdei împotriva infecției cu biofilm. Debridarea plăgii poate perturba fizic biofilmul și poate îndepărta cea mai mare parte a bioburdenului, dar răspunsul imun al gazdei poate fi ineficient împotriva biofilmului rămas, mai ales dacă răspunsul imun al gazdei este compromis. Astfel, terapiile antimicrobiene, cum ar fi pansamentele de argint, pot susține răspunsul imun al gazdei și pot elimina infecțiile cu biofilm. Compoziția, concentrația, solubilitatea și substratul de livrare pot influența eficacitatea antimicrobiană a argintului. În ultimii ani, progresele tehnologiei de prelucrare a argintului au făcut ca aceste pansamente să fie mai eficiente9,23. Pe măsură ce tehnologia de pansament de argint avansează, este important să înțelegem eficacitatea acestor pansamente în controlul infecției rănilor și, mai important, impactul acestor forme puternice de argint asupra mediului și vindecării plăgii.
În acest studiu, am comparat eficacitatea a două pansamente avansate de argint cu pansamente convenționale de argint care produc ioni Ag1+ împotriva biofilmelor folosind modele diferite in vitro și in vivo. De asemenea, am evaluat efectul acestor pansamente asupra mediului plăgii și vindecării independente de infecție. Pentru a minimiza influența matricei de livrare, toate pansamentele de argint testate au fost compuse din carboximetilceluloză.
Evaluarea noastră preliminară a acestor pansamente de argint împotriva biofilmelor coloniale ale Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus arată că, spre deosebire de pansamentele tradiționale Ag1+, două pansamente avansate de argint, Ag1++ EDTA/BC și săruri Ag oxigenate sunt eficiente la 5. Uciderea eficientă a Biofilm Bacteria în interior Câteva zile. În plus, aceste pansamente împiedică reformarea biofilmului la expunerea repetată la bacteriile planctonice. Pansamentul Ag1+ conținea clorură de argint, același compus de argint și matrice de bază ca Ag1++ EDTA/BC și a avut un efect limitat asupra viabilității bacteriene în biofilm în aceeași perioadă. Observația că un pansament Ag1++ EDTA/BC a fost mai eficient împotriva biofilmului decât un pansament Ag1+ format din aceeași matrice și un compus de argint susține ideea că sunt necesare ingrediente suplimentare pentru a crește eficacitatea clorurii de argint împotriva biofilmului, după cum a fost raportat în altă parte15. Aceste rezultate susțin ideea că BC și EDTA joacă un rol suplimentar care contribuie la eficacitatea generală a pansamentului și că absența acestei componente în pansamentele Ag1+ ar fi putut contribui la eșecul de a demonstra eficacitatea in vitro. Am constatat că pansamentele de sare Ag oxigenate care produc ioni Ag2+ și Ag3+ au prezentat o eficacitate antibacteriană mai puternică decât Ag1+ și la niveluri similare cu Ag1++ EDTA/BC. Cu toate acestea, din cauza potențialului ridicat de redox, nu este clar cât timp rămân ioni Ag3+ activi și eficienți împotriva biofilmelor rănilor și, prin urmare, merită un studiu suplimentar. În plus, există multe pansamente diferite care generează ioni Ag1+ care nu au fost testați în acest studiu. Aceste pansamente sunt compuse din diferiți compuși de argint, concentrații și matrici de bază, care pot influența livrarea de ioni Ag1+ și eficacitatea acestora împotriva biofilmelor. De asemenea, este demn de remarcat faptul că există multe modele diferite in vitro și in vivo utilizate pentru a evalua eficacitatea pansamentelor cu răni împotriva biofilmelor. Tipul de model utilizat, precum și conținutul de sare și proteine din mediul utilizat în aceste modele, vor influența eficacitatea pansamentului. În modelul nostru in vivo, am permis biofilmului să se maturizeze in vitro și apoi l -am transferat pe suprafața dermică a plăgii. Răspunsul imun al mouse -ului gazdă este relativ eficient împotriva bacteriilor planctonice aplicate pe rană, formând astfel un biofilm pe măsură ce rana se vindecă. Adăugarea de biofilm matur la o rană limitează eficacitatea răspunsului imun gazdă la formarea biofilmului, permițând biofilmului matur să se stabilească în interiorul plăgii înainte de a începe vindecarea. Astfel, modelul nostru ne permite să evaluăm eficacitatea pansamentelor antimicrobiene pe biofilme mature înainte ca rănile să înceapă să se vindece.
Am constatat, de asemenea, că pansamentul de îmbrăcăminte a influențat eficacitatea pansamentelor de argint pe biofilme crescute in vitro și pielea porcină. Contactul strâns cu rana este considerat critic pentru eficacitatea antimicrobiană a pansamentului24,25. Pansamentele care conțin săruri Ag oxigenate au fost în contact strâns cu biofilme mature, ceea ce a dus la o reducere semnificativă a numărului de bacterii viabile din biofilm după 24 de ore. În schimb, atunci când sunt tratate cu pansamente Ag1+ și Ag1++ EDTA/BC, a rămas un număr semnificativ de bacterii viabile. Aceste pansamente conțin suturi de -a lungul întregii lungimi a pansamentului, ceea ce creează spații moarte care împiedică contactul strâns cu biofilmul. În studiile noastre in vitro, aceste zone fără contact au împiedicat uciderea bacteriilor viabile în biofilm. Am evaluat viabilitatea bacteriană numai după 24 de ore de tratament; De -a lungul timpului, pe măsură ce pansamentul devine mai saturat, poate exista mai puțin spațiu mort, reducând zona pentru aceste bacterii viabile. Cu toate acestea, acest lucru evidențiază importanța compoziției pansamentului, nu doar tipul de argint din pansament.
În timp ce studiile in vitro sunt utile pentru a compara eficacitatea diferitelor tehnologii de argint, este, de asemenea, important să înțelegem efectele acestor pansamente asupra biofilmelor in vivo, unde țesutul gazdă și răspunsurile imune contribuie la eficacitatea pansamentelor împotriva biofilmelor. Efectul acestor pansamente asupra biofilmelor rănilor a fost observat folosind microscopie electronică de scanare și colorarea EPS a biofilmului folosind coloranți de ADN intracelular și extracelular. Am constatat că, după 3 zile de tratament, toate pansamentele au fost eficiente în reducerea ADN-ului fără celule în rănile infectate cu biofilm, dar pansamentul Ag1+ a fost mai puțin eficient în rănile infectate cu Staphylococcus aureus. Microscopia electronică de scanare a arătat, de asemenea, că în mod semnificativ mai puține bacterii au fost prezente în rănile tratate cu pansamentele de argint, deși acest lucru a fost mai pronunțat cu pansamentul cu sare Ag oxigenat și pansamentul Ag1++ EDTA/BC în comparație cu pansamentul Ag1+. Aceste date arată că pansamentele de argint testate au avut grade diferite de impact asupra structurii biofilmului, dar niciuna dintre pansamentele de argint nu a reușit să eradice biofilmul, susținând necesitatea unei abordări holistice a tratamentului infecțiilor cu biofilm; Utilizarea brațelor de argint. Tratamentul este precedat de debridare fizică pentru a îndepărta cea mai mare parte a biofilmului.
Rănile cronice sunt adesea într -o stare de inflamație severă, în excesul de celule inflamatorii rămânând în țesutul plăgii pentru o perioadă îndelungată de timp, provocând deteriorarea țesuturilor și epuizând oxigenul necesar pentru metabolismul celular eficient și funcția în rana26. Biofilmele agravează acest mediu ostil al plăgii prin afectarea negativă a vindecării într -o varietate de moduri, inclusiv inhibarea proliferării celulare și migrației și activarea citokinelor proinflamatorii27. Pe măsură ce pansamentele de argint devin mai eficiente, este important să înțelegem impactul pe care îl au asupra mediului și vindecării rănilor.
Interesant este că, deși toate pansamentele de argint au afectat compoziția biofilmului, numai pansamentele cu sare de argint oxigenate au crescut reepitelializarea acestor răni infectate. Aceste date susțin descoperirile noastre anterioare17 și cele ale lui Kalan și colab. (2017) 28, ceea ce a demonstrat profiluri bune de siguranță și toxicitate ale sărurilor de argint oxigenate, deoarece concentrații mai mici de argint au fost eficiente împotriva biofilmelor.
Studiul nostru actual evidențiază diferențele de tehnologie de argint dintre pansamentele de argint antimicrobiene și impactul acestei tehnologii asupra mediului plăgii și vindecarea independentă de infecție. Cu toate acestea, aceste rezultate diferă de studiile anterioare care arată că pansamentul Ag1 + + EDTA/BC au îmbunătățit parametrii de vindecare îmbunătățiți ai urechilor de iepure răniți in vivo. Cu toate acestea, acest lucru se poate datora diferențelor dintre modelele animale, timpii de măsurare și metodele de aplicare bacteriană29. În acest caz, măsurătorile rănilor au fost luate la 12 zile după rănire pentru a permite ingredientelor active ale pansamentului să acționeze asupra biofilmului pe o perioadă mai lungă de timp. Acest lucru este susținut de un studiu care a arătat că ulcerațiile de picioare infectate clinic tratate cu Ag1 + + EDTA/BC au crescut inițial ca mărime după o săptămână de tratament, și apoi în următoarele 3 săptămâni de tratament cu Ag1 + + EDTA/BC și în 4 săptămâni de la Utilizarea non-antimicrobiene. droguri. Pansamente CMC pentru a reduce dimensiunea ulcerelor30.
Anumite forme și concentrații de argint s -au dovedit anterior citotoxice in vitro 11, dar aceste rezultate in vitro nu se traduc întotdeauna în efecte adverse in vivo. În plus, progresele în tehnologia de argint și o mai bună înțelegere a compușilor și concentrațiilor de argint în pansamente au dus la dezvoltarea multor pansamente de argint sigure și eficiente. Cu toate acestea, pe măsură ce tehnologia de pansament de argint avansează, este important să înțelegem impactul acestor pansamente asupra mediului de rană31,32,33. S-a raportat anterior că rata crescută de reepitelializare corespunde unei proporții crescute de macrofage M2 antiinflamatorii în comparație cu fenotipul M1 pro-inflamator. Acest lucru a fost remarcat într-un model anterior de șoarece, unde pansamentele cu rani de hidrogel argintiu au fost comparate cu sulfadiazină de argint și hidrogeluri non-antimicrobiene34.
Rănile cronice pot prezenta inflamație excesivă și s -a observat că prezența excesului de neutrofile poate fi în detrimentul vindecării rănilor35. Într-un studiu la șoarecii epuizați de neutrofile, prezența neutrofilelor a întârziat reepitelializarea. Prezența excesului de neutrofile duce la niveluri ridicate de proteaze și specii reactive de oxigen, cum ar fi superoxidul și peroxidul de hidrogen, care sunt asociate cu răni de vindecare cronică și lentă37,38. De asemenea, o creștere a numărului de macrofage, dacă este necontrolat, poate duce la vindecarea întârziată a rănilor39. Această creștere este deosebit de importantă dacă macrofagele nu pot trece de la un fenotip pro-inflamator la un fenotip pro-vindecare, ceea ce duce la rănile care nu reușesc să iasă din faza inflamatorie a vindecării40. Am observat o scădere a neutrofilelor și a macrofagelor în rănile infectate cu biofilm după 3 zile de tratament cu toate pansamentele de argint, dar scăderea a fost mai pronunțată cu pansamentele de sare oxigenate. Această scădere poate fi un rezultat direct al răspunsului imun la argint, un răspuns la scăderea bioburdenului sau rana fiind într -o etapă ulterioară de vindecare și, prin urmare, celulele imune în rana fiind reduse. Reducerea numărului de celule inflamatorii din rană poate menține un mediu propice vindecării rănilor. Mecanismul de acțiune al modului în care oxysalturile Ag promovează vindecarea independentă de infecție nu este clar, dar capacitatea Ag oxysalts de a produce oxigen și de a distruge nivelurile nocive de peroxid de hidrogen, un mediator al inflamației, poate explica acest lucru și necesită un studiu suplimentar17.
Rănile cronice care nu se vindecă infectate reprezintă o problemă atât pentru medici, cât și pentru pacienți. Deși multe pansamente pretind eficiență antimicrobiană, cercetările se concentrează rar pe alți factori cheie care influențează microambientul plăgii. Acest studiu arată că diferite tehnologii de argint au eficacitate antimicrobiană diferită și, mai important, efecte diferite asupra mediului și vindecării plăgii, independent de infecție. Deși aceste studii in vitro și in vivo arată eficacitatea acestor pansamente în tratarea infecțiilor rănilor și promovarea vindecării, sunt necesare studii randomizate controlate pentru a evalua eficacitatea acestor pansamente în clinică.
Seturile de date utilizate și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător la o cerere rezonabilă.
Ora post: 15-2024 iulie