Heterogenitatea fibrelor musculare scheletice umane dincolo de lanțul greu de miozină

Vă mulțumim că ați vizitat nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați cea mai recentă versiune de browser (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). În plus, pentru a asigura asistență continuă, acest site nu va conține stiluri și JavaScript.
Mușchiul scheletic este un țesut eterogen compus predominant din miofibrile, care la om sunt de obicei clasificate în trei tipuri: unul „lent” (tipul 1) și două „rapide” (tipurile 2A și 2X). Cu toate acestea, heterogenitatea între și în cadrul tipurilor tradiționale de miofibrile rămâne puțin înțeleasă. Am aplicat abordări transcriptomice și proteomice la 1050 și, respectiv, 1038 de miofibrile individuale din vastus lateralis uman. Studiul proteomic a inclus bărbați, iar studiul transcriptomic a inclus 10 bărbați și 2 femei. Pe lângă izoformele lanțului greu de miozină, am identificat proteine ​​metabolice, proteine ​​ribozomale și proteine ​​joncțiune celulară ca surse de variabilitate intermiofibrilă multidimensională. În plus, în ciuda identificării grupurilor de fibre lente și rapide, datele noastre sugerează că fibrele de tip 2X sunt fenotipic indistinguibile de alte fibre cu contracție rapidă. În plus, clasificarea bazată pe lanțul greu de miozină este insuficientă pentru a descrie fenotipul miofibrelor în miopatiile nemaline. Per ansamblu, datele noastre sugerează o eterogenitate multidimensională a miofibrelor, cu surse de variație care se extind dincolo de izoformele lanțului greu de miozină.
Heterogenitatea celulară este o caracteristică inerentă a tuturor sistemelor biologice, permițând celulelor să se specializeze pentru a satisface diferitele nevoi ale țesuturilor și celulelor.1 Viziunea tradițională asupra eterogenității fibrelor musculare scheletice a fost că neuronii motori definesc tipul de fibră dintr-o unitate motorie și că tipul de fibră (adică tipul 1, tipul 2A și tipul 2X la om) este determinat de caracteristicile izoformelor lanțului greu de miozină (MYH).2 Aceasta s-a bazat inițial pe instabilitatea ATP-azei pH-ului lor,3,4 și mai târziu pe expresia moleculară a MYH.5 Cu toate acestea, odată cu identificarea și acceptarea ulterioară a fibrelor „mixte” care co-exprimă mai multe MYH în proporții variabile, fibrele musculare scheletice sunt din ce în ce mai mult privite ca un continuum, mai degrabă decât ca tipuri distincte de fibre.6 În ciuda acestui fapt, domeniul se bazează încă în mare măsură pe MYH ca principal clasificator pentru clasificarea miofibrelor, o viziune probabil influențată de limitările și prejudecățile semnificative ale studiilor timpurii pe rozătoare ale căror profiluri de expresie MYH și gamă de tipuri de fibre diferă de cele de la om.2 Situația este complicată și mai mult de faptul că diferiți mușchi scheletici umani prezintă o gamă diversă de tipuri de fibre.7 Vastus lateralis este un mușchi mixt cu un profil de expresie MYH intermediar (și, prin urmare, reprezentativ).7 În plus, ușurința eșantionării îl face mușchiul cel mai bine studiat la om.
Prin urmare, investigarea imparțială a diversității fibrelor musculare scheletice folosind instrumente puternice de „omică” este critică, dar și dificilă, în parte datorită naturii multinucleate a fibrelor musculare scheletice. Cu toate acestea, tehnologiile de transcriptomică8,9 și proteomică10 au suferit o revoluție în ceea ce privește sensibilitatea în ultimii ani datorită diverselor progrese tehnologice, permițând analiza mușchiului scheletic la rezoluție de fibră unică. Drept urmare, s-au înregistrat progrese semnificative în caracterizarea diversității fibrelor unice și a răspunsului acestora la stimuli atrofici și la îmbătrânire11,12,13,14,15,16,17,18. Este important de menționat că aceste progrese tehnologice au aplicații clinice, permițând o caracterizare mai detaliată și mai precisă a disreglării asociate bolilor. De exemplu, fiziopatologia miopatiei nemalinice, una dintre cele mai frecvente boli musculare ereditare (MIM 605355 și MIM 161800), este complexă și confuză.19,20 Prin urmare, o mai bună caracterizare a disreglării fibrelor musculare scheletice ar putea duce la progrese semnificative în înțelegerea acestei boli.
Am dezvoltat metode pentru analiza transcriptomică și proteomică a fibrelor musculare scheletice individuale, izolate manual din specimene de biopsie umană, și le-am aplicat la mii de fibre, permițându-ne să investigăm eterogenitatea celulară a fibrelor musculare scheletice umane. În cursul acestei lucrări, am demonstrat puterea fenotipării transcriptomice și proteomice a fibrelor musculare și am identificat proteinele metabolice, ribozomale și joncțiune celulară ca surse semnificative de variabilitate interfibră. Mai mult, utilizând acest flux de lucru proteomic, am caracterizat relevanța clinică a miopatiei nematodice în fibrele musculare scheletice individuale, dezvăluind o schimbare coordonată către fibre neoxidative, independent de tipul de fibră, pe baza miopatiei nematodice.
Pentru a investiga eterogenitatea fibrelor musculare scheletice umane, am dezvoltat două fluxuri de lucru pentru a permite analiza transcriptomului și proteomului fibrelor musculare scheletice individuale (Figura 1A și Figura suplimentară 1A). Am dezvoltat și optimizat mai mulți pași metodologici, de la stocarea probelor și conservarea integrității ARN-ului și proteinelor până la optimizarea randamentului pentru fiecare abordare. Pentru analiza transcriptomului, acest lucru a fost realizat prin inserarea unor coduri de bare moleculare specifice probei în etapa inițială a transcripției inverse, permițând gruparea a 96 de fibre pentru o procesare ulterioară eficientă. Secvențierea mai profundă (±1 milion de citiri per fibră) în comparație cu abordările tradiționale cu o singură celulă a îmbogățit și mai mult datele transcriptomului.21 Pentru proteomică, am utilizat un gradient cromatografic scurt (21 de minute) combinat cu achiziția de date DIA-PASEF pe un spectrometru de masă timsTOF pentru a optimiza adâncimea proteomului, menținând în același timp un randament ridicat. 22,23 Pentru a investiga heterogenitatea fibrelor musculare scheletice sănătoase, am caracterizat transcriptomele a 1.050 de fibre individuale de la 14 donatori adulți sănătoși și proteomele a 1.038 de fibre de la 5 donatori adulți sănătoși (Tabelul suplimentar 1). În această lucrare, aceste seturi de date sunt denumite transcriptomele și proteomii de 1.000 de fibre. Abordarea noastră a detectat un total de 27.237 de transcrieri și 2.983 de proteine ​​în analizele transcriptomice și proteomice de 1.000 de fibre (Figura 1A, Seturi de date suplimentare 1-2). După filtrarea seturilor de date transcriptomice și proteomice pentru >1.000 de gene detectate și 50% valori valide per fibră, au fost efectuate analize bioinformatice ulterioare pentru 925 și 974 de fibre din transcriptom și proteom, respectiv. După filtrare, s-au detectat în medie 4257 ± 1557 gene și 2015 ± 234 proteine ​​(medie ± deviație standard) per fibră, cu o variabilitate interindividuală limitată (Figurile suplimentare 1B-C, Seturi de date suplimentare 3-4). Cu toate acestea, variabilitatea intra-subiectiv a fost mai pronunțată între participanți, probabil din cauza diferențelor de randament ARN/proteină între fibrele de lungimi și arii de secțiune transversală diferite. Pentru majoritatea proteinelor (>2000), coeficientul de variație a fost sub 20% (Figura suplimentară 1D). Ambele metode au permis captarea unei game dinamice largi de transcrieri și proteine ​​cu semnături puternic exprimate, importante pentru contracția musculară (de exemplu, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figurile suplimentare 1E-F). Majoritatea caracteristicilor identificate au fost comune între seturile de date transcriptomice și proteomice (Figura suplimentară 1G), iar intensitățile medii UMI/LFQ ale acestor caracteristici au fost corelate destul de bine (r = 0,52) (Figura suplimentară 1H).
Flux de lucru pentru transcriptomică și proteomică (creat cu BioRender.com). Curbe BD ale intervalului dinamic pentru MYH7, MYH2 și MYH1 și praguri calculate pentru atribuirea tipului de fibră. E, F Distribuția expresiei MYH între fibre în seturile de date transcriptomice și proteomice. G, H Grafice de aproximare și proiecție a diversității uniforme (UMAP) pentru transcriptomică și proteomică colorate în funcție de tipul de fibră bazat pe MYH. I, J Grafice de caracteristici care prezintă expresia MYH7, MYH2 și MYH1 în seturile de date transcriptomice și proteomice.
Inițial, ne-am propus să atribuim fiecărei fibre un tip de fibră bazat pe MYH, utilizând o abordare optimizată care profită de sensibilitatea ridicată și gama dinamică a expresiei MYH în seturile de date omice. Studiile anterioare au utilizat praguri arbitrare pentru a eticheta fibrele ca fiind de tip 1 pur, tip 2A, tip 2X sau mixte, pe baza unui procent fix de expresie a diferitelor MYH-uri11,14,24. Am utilizat o abordare diferită în care expresia fiecărei fibre a fost clasificată în funcție de MYH-urile pe care le-am folosit pentru a tipa fibrele: MYH7, MYH2 și MYH1, corespunzătoare fibrelor de tip 1, tip 2A și respectiv tip 2X. Apoi, am calculat matematic punctul de inflexiune inferior al fiecărei curbe rezultate și l-am folosit ca prag pentru a atribui fibrele ca fiind pozitive (peste prag) sau negative (sub prag) pentru fiecare MYH (Figura 1B-D). Aceste date demonstrează că MYH7 (Figura 1B) și MYH2 (Figura 1C) au profiluri de expresie on/off mai distincte la nivel de ARN în comparație cu nivelul proteinei. Într-adevăr, la nivel proteic, foarte puține fibre nu au exprimat MYH7 și nicio fibră nu a avut o expresie MYH2 de 100%. Am folosit apoi praguri de expresie predeterminate pentru a atribui tipuri de fibre bazate pe MYH tuturor fibrelor din fiecare set de date. De exemplu, fibrele MYH7+/MYH2-/MYH1- au fost atribuite tipului 1, în timp ce fibrele MYH7-/MYH2+/MYH1+ au fost atribuite tipului mixt 2A/2X (a se vedea tabelul suplimentar 2 pentru o descriere completă). Combinând toate fibrele, am observat o distribuție remarcabil de similară a tipurilor de fibre bazate pe MYH atât la nivel de ARN (Figura 1E), cât și la nivel de proteine ​​(Figura 1F), în timp ce compoziția relativă a tipurilor de fibre bazate pe MYH a variat între indivizi, așa cum era de așteptat (Figura suplimentară 2A). Majoritatea fibrelor au fost clasificate fie ca tip 1 pur (34-35%), fie ca tip 2A (36-38%), deși a fost detectat și un număr semnificativ de fibre mixte de tip 2A/2X (16-19%). O diferență izbitoare este că fibrele pure de tip 2X au putut fi detectate doar la nivel de ARN, dar nu și la nivel de proteine, ceea ce sugerează că expresia rapidă MYH este cel puțin parțial reglată post-transcripțional.
Am validat metoda noastră de tipizare a fibrelor MYH bazată pe proteomică utilizând dot blotting bazat pe anticorpi, iar ambele metode au obținut o concordanță de 100% în identificarea fibrelor pure de tip 1 și de tip 2A (a se vedea Figura suplimentară 2B). Cu toate acestea, abordarea bazată pe proteomică a fost mai sensibilă, mai eficientă în identificarea fibrelor mixte și cuantificarea proporției fiecărei gene MYH din fiecare fibră. Aceste date demonstrează eficacitatea utilizării unei abordări obiective, bazate pe omică, extrem de sensibile, pentru a caracteriza tipurile de fibre musculare scheletice.
Apoi, am folosit informațiile combinate furnizate de transcriptomică și proteomică pentru a clasifica obiectiv miofibrele pe baza transcriptomului sau proteomului lor complet. Folosind metoda de aproximare și proiecție a varietății uniforme (UMAP) pentru a reduce dimensionalitatea la șase componente principale (Figurile suplimentare 3A-B), am putut vizualiza variabilitatea miofibrelor în transcriptom (Figura 1G) și proteom (Figura 1H). În mod special, miofibrele nu au fost grupate după participanți (Figurile suplimentare 3C-D) sau zile de testare (Figura suplimentară 3E) nici în seturile de date transcriptomice, nici în cele proteomice, ceea ce sugerează că variabilitatea intra-subiecți în fibrele musculare scheletice este mai mare decât variabilitatea între subiecți. În graficul UMAP, au apărut două clustere distincte reprezentând miofibrele „rapide” și „lente” (Figurile 1G-H). Miofibrele MYH7+ (lente) au fost grupate la polul pozitiv al UMAP1, în timp ce miofibrele MYH2+ și MYH1+ (rapide) au fost grupate la polul negativ al UMAP1 (Figurile 1I-J). Cu toate acestea, nu s-a făcut nicio distincție între tipurile de fibre cu contracție rapidă (adică tip 2A, tip 2X sau mixte 2A/2X) pe baza expresiei MYH, ceea ce sugerează că expresia MYH1 (Figura 1I-J) sau a altor markeri clasici de miofibre 2X, cum ar fi ACTN3 sau MYLK2 (Figurile suplimentare 4A-B), nu diferențiază între diferite tipuri de miofibre atunci când se ia în considerare întregul transcriptom sau proteom. Mai mult, în comparație cu MYH2 și MYH7, puține transcrieri sau proteine ​​au fost corelate pozitiv cu MYH1 (Figurile suplimentare 4C-H), ceea ce sugerează că abundența MYH1 nu reflectă pe deplin transcriptomul/proteomul miofibrelor. Concluzii similare s-au tras la evaluarea expresiei mixte a celor trei izoforme MYH la nivelul UMAP (Figurile suplimentare 4I-J). Astfel, în timp ce fibrele 2X pot fi identificate la nivel de transcript doar pe baza cuantificării MYH, fibrele MYH1+ nu se disting de alte fibre rapide atunci când se ia în considerare întregul transcriptom sau proteom.
Ca o explorare inițială a eterogenității fibrelor lente dincolo de MYH, am evaluat patru proteine ​​specifice tipurilor de fibre lente: TPM3, TNNT1, MYL3 și ATP2A22. Subtipurile de fibre lente au prezentat corelații Pearson ridicate, deși nu perfecte, cu MYH7 atât în ​​transcriptomică (Figura suplimentară 5A), cât și în proteomică (Figura suplimentară 5B). Aproximativ 25% și 33% dintre fibrele lente nu au fost clasificate drept fibre lente pure de către toate subtipurile de gene/proteine ​​în transcriptomică (Figura suplimentară 5C) și proteomică (Figura suplimentară 5D), respectiv. Prin urmare, clasificarea fibrelor lente bazată pe mai multe subtipuri de gene/proteine ​​introduce o complexitate suplimentară, chiar și pentru proteinele despre care se știe că sunt specifice tipului de fibre. Acest lucru sugerează că clasificarea fibrelor bazată pe izoformele unei singure familii de gene/proteine ​​poate să nu reflecte în mod adecvat adevărata eterogenitate a fibrelor musculare scheletice.
Pentru a explora în continuare variabilitatea fenotipică a fibrelor musculare scheletice umane la scara întregului model omic, am efectuat o reducere imparțială a dimensionalității datelor utilizând analiza componentelor principale (PCA) (Figura 2A). Similar graficelor UMAP, nici participantul, nici ziua de testare nu au influențat gruparea fibrelor la nivelul PCA (Figurile suplimentare 6A-C). În ambele seturi de date, tipul de fibră bazat pe MYH a fost explicat prin PC2, care a arătat un grup de fibre de tip 1 cu contracție lentă și un al doilea grup care conține fibre de tip 2A, tip 2X și fibre mixte 2A/2X cu contracție rapidă (Figura 2A). În ambele seturi de date, aceste două grupuri au fost conectate printr-un număr mic de fibre mixte de tip 1/2A. Așa cum era de așteptat, analiza suprareprezentării principalilor factori PC a confirmat că PC2 a fost determinat de semnături contractile și metabolice (Figura 2B și Figurile suplimentare 6D-E, Seturi de date suplimentare 5-6). În general, s-a constatat că tipul de fibră bazat pe MYH este suficient pentru a explica variația continuă de-a lungul PC2, cu excepția așa-numitelor fibre 2X care au fost distribuite în tot transcriptomul în cadrul clusterului rapid.
A. Grafice ale analizei componentelor principale (PCA) ale seturilor de date transcriptomice și proteomice colorate în funcție de tipul de fibră, pe baza MYH. B. Analiza de îmbogățire a driverelor de transcript și proteine ​​în PC2 și PC1. Analiza statistică a fost efectuată utilizând pachetul clusterProfiler și valorile p ajustate de Benjamini-Hochberg. C, D. Grafice PCA colorate în funcție de termenii ontologiei genei de adeziune intercelulară (GO) din transcriptom și termenii GO ai costamerilor din proteom. Săgețile reprezintă driverele de transcript și proteine ​​și direcțiile acestora. E, F. Grafice ale caracteristicilor de aproximare și proiecție a varietății uniforme (UMAP) ale caracteristicilor relevante clinic, care prezintă gradienți de expresie independenți de tipul de fibră lentă/rapidă. G, H. Corelații între driverele PC2 și PC1 în transcriptomi și proteomi.
În mod neașteptat, tipul de miofibră bazat pe MYH a explicat doar al doilea cel mai mare grad de variabilitate (PC2), sugerând că alți factori biologici care nu au legătură cu tipul de miofibră bazat pe MYH (PC1) joacă un rol important în reglarea eterogenității fibrelor musculare scheletice. Analiza suprareprezentării principalilor factori determinanți din PC1 a relevat că variabilitatea în PC1 a fost determinată în principal de aderența celulă-celulă și conținutul de ribozomi din transcriptom, precum și de costameri și proteine ​​ribozomale din proteom (Figura 2B și Figurile suplimentare 6D-E, Setul de date suplimentar 7). În mușchiul scheletic, costamerii conectează discul Z la sarcolem și sunt implicați în transmiterea și semnalizarea forței. 25 Graficele PCA adnotate folosind caracteristicile aderenței celulă-celulă (transcriptom, Figura 2C) și costameri (proteom, Figura 2D) au relevat o deplasare puternică la stânga în PC1, indicând faptul că aceste caracteristici sunt îmbogățite în anumite fibre.
O examinare mai detaliată a grupării miofibrelor la nivelul UMAP a relevat că majoritatea caracteristicilor au prezentat un gradient de expresie bazat pe MYH independent de tipul de miofibră, mai degrabă decât specific subclusterului de miofibre. Această continuitate a fost observată pentru mai multe gene asociate cu afecțiuni patologice (Figura 2E), cum ar fi CHCHD10 (boală neuromusculară), SLIT3 (atrofie musculară), CTDNEP1 (boală musculară). Această continuitate a fost observată și la nivelul proteomului, incluzând proteinele asociate cu tulburări neurologice (UGDH), semnalizarea insulinei (PHIP) și transcripția (HIST1H2AB) (Figura 2F). Colectiv, aceste date indică continuitatea heterogenității contracției lente/rapide independente de tipul de fibră în diferite miofibre.
Interesant este că genele driver din PC2 au prezentat o bună corelație transcriptom-proteom (r = 0,663) (Figura 2G), sugerând că tipurile de fibre cu contracție lentă și rapidă, și în special proprietățile contractile și metabolice ale fibrelor musculare scheletice, sunt reglate transcripțional. Cu toate acestea, genele driver din PC1 nu au prezentat nicio corelație transcriptom-proteom (r = -0,027) (Figura 2H), sugerând că variațiile care nu au legătură cu tipurile de fibre cu contracție lentă/rapidă sunt în mare măsură reglate post-transcripțional. Deoarece variațiile din PC1 au fost explicate în primul rând prin termeni de ontologie genetică ribozomală și având în vedere că ribozomii joacă un rol crucial și specializat în celulă prin participarea activă la și influențarea translației proteinelor,31 ne-am propus în continuare să investigăm această heterogenitate ribozomală neașteptată.
Am colorat mai întâi graficul analizei componentelor principale proteomice în funcție de abundența relativă a proteinelor din termenul GOCC „ribozom citoplasmatic” (Figura 3A). Deși acest termen este îmbogățit pe partea pozitivă a PC1, rezultând un gradient mic, proteinele ribozomale determină partiționarea în ambele direcții a PC1 (Figura 3A). Proteinele ribozomale îmbogățite pe partea negativă a PC1 au inclus RPL18, RPS18 și RPS13 (Figura 3B), în timp ce RPL31, RPL35 și RPL38 (Figura 3C) au fost principalii factori determinanți pe partea pozitivă a PC1. Interesant este că RPL38 și RPS13 au fost puternic exprimate în mușchii scheletici în comparație cu alte țesuturi (Figura suplimentară 7A). Aceste semnături ribozomale distinctive în PC1 nu au fost observate în transcriptom (Figura suplimentară 7B), indicând o reglare post-transcripțională.
A. Graficul analizei componentelor principale (PCA) colorat conform termenilor ontologiei genei ribozomale citoplasmatice (GO) de-a lungul proteomului. Săgețile indică direcția variației mediate de proteine ​​în graficul PCA. Lungimea liniei corespunde scorului componentei principale pentru o anumită proteină. B, C. Grafice ale caracteristicilor PCA pentru RPS13 și RPL38. D. Analiză de clusterizare ierarhică nesupervizată a proteinelor ribozomale citoplasmatice. E. Model structural al ribozomului 80S (PDB: 4V6X) care evidențiază proteinele ribozomale cu abundențe diferite în fibrele musculare scheletice. F. Proteine ​​ribozomale cu stoichiometrie diferită localizate în apropierea canalului de ieșire al ARNm.
Conceptele de heterogenitate și specializare ribozomală au fost propuse anterior, prin care prezența unor subpopulații distincte de ribozomi (heterogenitate ribozomală) poate influența direct traducerea proteinelor în diferite țesuturi32 și celule33 prin traducerea selectivă a unor seturi specifice de transcrieri de ARNm34 (specializare ribozomală). Pentru a identifica subpopulațiile de proteine ​​ribozomale co-exprimate în fibrele musculare scheletice, am efectuat o analiză de clusterizare ierarhică nesupervizată a proteinelor ribozomale din proteom (Figura 3D, Setul suplimentar de date 8). Așa cum era de așteptat, proteinele ribozomale nu s-au grupat în funcție de tipul de fibră pe baza MYH. Cu toate acestea, am identificat trei grupuri distincte de proteine ​​ribozomale; primul grup (ribozomal_cluster_1) este coreglat cu RPL38 și, prin urmare, are o expresie crescută în fibrele cu un profil PC1 pozitiv. Al doilea grup (ribozomal_cluster_2) este coreglat cu RPS13 și este crescut în fibrele cu un profil PC1 negativ. Al treilea cluster (ribozomal_cluster_3) nu prezintă o expresie diferențială coordonată în fibrele musculare scheletice și poate fi considerat proteina ribozomală „centrală” a mușchilor scheletici. Ambele clustere ribozomale 1 și 2 conțin proteine ​​ribozomale despre care s-a demonstrat anterior că reglează traducerea alternativă (de exemplu, RPL10A, RPL38, RPS19 și RPS25) și influențează funcțional dezvoltarea (de exemplu, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 În concordanță cu rezultatele PCA, reprezentarea eterogenă observată a acestor proteine ​​ribozomale în fibre a arătat, de asemenea, continuitate (Figura suplimentară 7C).
Pentru a vizualiza locația proteinelor ribozomale eterogene în ribozom, am utilizat un model structural al ribozomului uman 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). După izolarea proteinelor ribozomale aparținând diferitelor clustere ribozomale, locațiile acestora nu au fost strâns aliniate, ceea ce sugerează că abordarea noastră nu a reușit să ofere îmbogățire pentru anumite regiuni/fracțiuni ale ribozomului. Interesant este însă că proporția de proteine ​​cu subunități mari din clusterul 2 a fost mai mică decât în ​​clusterele 1 și 3 (Figura suplimentară 7D). Am observat că proteinele cu stoichiometrie alterată în fibrele musculare scheletice au fost localizate predominant la suprafața ribozomului (Figura 3E), în concordanță cu capacitatea lor de a interacționa cu elementele interne ale situsului de intrare a ribozomilor (IRES) în diferite populații de ARNm, coordonând astfel traducerea selectivă. 40, 41 În plus, multe proteine ​​cu stoichiometrie alterată în fibrele musculare scheletice au fost localizate în apropierea regiunilor funcționale, cum ar fi tunelul de ieșire al ARNm (Figura 3F), care reglează selectiv alungirea translațională și oprirea peptidelor specifice. 42 În concluzie, datele noastre sugerează că stoichiometria proteinelor ribozomale din mușchii scheletici prezintă eterogenitate, rezultând diferențe între fibrele musculare scheletice.
În continuare, ne-am propus să identificăm semnăturile fibrelor cu contracție rapidă și lentă și să explorăm mecanismele reglării lor transcripționale. Comparând grupurile de fibre cu contracție rapidă și lentă definite de UMAP în cele două seturi de date (Figurile 1G-H și 4A-B), analizele transcriptomice și proteomice au identificat 1366 și, respectiv, 804 caracteristici diferențiate abundente (Figurile 4A-B, Seturi de date suplimentare 9-12). Am observat diferențele așteptate în semnăturile legate de sarcomere (de exemplu, tropomiozină și troponină), cuplarea excitație-contracție (izoformele SERCA) și metabolismul energetic (de exemplu, ALDOA și CKB). Mai mult, transcrierile și proteinele care reglează ubiquitinarea proteinelor au fost exprimate diferențiat în fibrele cu contracție rapidă și lentă (de exemplu, USP54, SH3RF2, USP28 și USP48) (Figurile 4A-B). Mai mult, gena proteinei microbiene RP11-451G4.2 (DWORF), despre care s-a demonstrat anterior că este exprimată diferențial în diferitele tipuri de fibre musculare de miel43 și amplifică activitatea SERCA în mușchiul cardiac44, a fost semnificativ suprareglată în fibrele musculare scheletice lente (Figura 4A). În mod similar, la nivel individual de fibră, s-au observat diferențe semnificative în semnăturile cunoscute, cum ar fi izoformele lactat dehidrogenază legate de metabolism (LDHA și LDHB, Figura 4C și Figura suplimentară 8A)45,46, precum și semnături specifice tipului de fibră necunoscute anterior (cum ar fi IRX3, USP54, USP28 și DPYSL3) (Figura 4C). A existat o suprapunere semnificativă a caracteristicilor exprimate diferențial între seturile de date transcriptomice și proteomice (Figura suplimentară 8B), precum și o corelație de modificare a oriilor determinată în principal de exprimarea diferențială mai pronunțată a caracteristicilor sarcomerilor (Figura suplimentară 8C). În mod special, unele semnături (de exemplu, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) au prezentat o reglare post-transcripțională puternică doar la nivel proteomic și au avut profiluri de expresie specifice tipului de fibre cu contracție lentă/rapidă (Figura suplimentară 8C).
Graficele vulcanului A și B comparând clusterele lente și rapide identificate prin graficele de aproximare și proiecție a varietății uniforme (UMAP) din Figurile 1G-H. Punctele colorate reprezintă transcrieri sau proteine ​​care sunt semnificativ diferite la FDR < 0,05, iar punctele mai întunecate reprezintă transcrieri sau proteine ​​care sunt semnificativ diferite la o modificare logaritmică > 1. Analiza statistică bidirecțională a fost efectuată utilizând testul DESeq2 Wald cu valori p ajustate Benjamini-Hochberg (transcriptomică) sau metoda modelului liniar Limma cu analiză bayesiană empirică, urmată de ajustarea Benjamini-Hochberg pentru comparații multiple (proteomică). C Grafice de semnătură ale genelor sau proteinelor selectate exprimate diferențial între fibrele lente și rapide. D Analiza de îmbogățire a transcrierilor și proteinelor exprimate diferențial semnificativ. Valorile suprapuse sunt îmbogățite în ambele seturi de date, valorile transcriptomului sunt îmbogățite doar în transcriptom, iar valorile proteomului sunt îmbogățite doar în proteom. Analiza statistică a fost efectuată utilizând pachetul clusterProfiler cu valori p ajustate Benjamini-Hochberg. E. Factori de transcripție specifici tipului de fibre identificați de SCENIC pe baza scorurilor de specificitate a regulatorului derivate din SCENIC și a expresiei diferențiale a ARNm între tipurile de fibre. F. Profilarea factorilor de transcripție selectați exprimați diferențial între fibrele lente și rapide.
Apoi am efectuat o analiză de suprareprezentare a genelor și proteinelor reprezentate diferențial (Figura 4D, Setul de date suplimentar 13). Îmbogățirea căilor metabolice pentru caracteristici care diferă între cele două seturi de date a relevat diferențe așteptate, cum ar fi procesele de β-oxidare a acizilor grași și metabolismul cetonelor (fibre lente), contracția miofilamentului/muscular (fibre rapide și, respectiv, lente) și procesele catabolice ale carbohidraților (fibre rapide). Activitatea serin/treonin protein fosfatazei a fost, de asemenea, crescută în fibrele rapide, determinată de caracteristici precum subunitățile fosfatazei reglatoare și catalitice (PPP3CB, PPP1R3D și PPP1R3A), despre care se știe că reglează metabolismul glicogenului (47) (Figurile suplimentare 8D-E). Alte căi îmbogățite în fibre rapide au inclus corpii de procesare (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) în proteom (Fig. suplimentară 8F), potențial implicați în reglarea post-transcripțională (48), și activitatea factorilor de transcripție (SREBF1, RXRG, RORA) în transcriptom (Fig. suplimentară 8G). Fibrele lente au fost îmbogățite în activitatea oxidoreductazei (BDH1, DCXR, TXN2) (Fig. suplimentară 8H), legarea amidei (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Fig. suplimentară 8I), matricea extracelulară (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Fig. suplimentară 8J) și activitatea receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Fig. suplimentară 8K).
Pentru a obține o perspectivă mai profundă asupra reglării transcripționale care stă la baza caracteristicilor fibrelor musculare lente/rapide, am efectuat o analiză de îmbogățire a factorilor de transcripție utilizând SCENIC49 (Setul de date suplimentar 14). Mulți factori de transcripție au fost îmbogățiți semnificativ între fibrele musculare rapide și lente (Figura 4E). Aceștia au inclus factori de transcripție precum MAFA, care a fost anterior asociat cu dezvoltarea rapidă a fibrelor musculare,50 precum și mai mulți factori de transcripție care nu au fost asociați anterior cu programe genetice specifice tipului de fibre musculare. Printre aceștia, PITX1, EGR1 și MYF6 au fost cei mai îmbogățiți factori de transcripție în fibrele musculare rapide (Figura 4E). În schimb, ZSCAN30 și EPAS1 (cunoscut și sub numele de HIF2A) au fost cei mai îmbogățiți factori de transcripție în fibrele musculare lente (Figura 4E). În concordanță cu aceasta, MAFA a fost exprimat la niveluri mai ridicate în regiunea UMAP corespunzătoare fibrelor musculare rapide, în timp ce EPAS1 a avut modelul de expresie opus (Figura 4F).
Pe lângă genele cunoscute care codifică proteine, există numeroase biotipuri de ARN necodificatoare care pot fi implicate în reglarea dezvoltării și bolilor umane. 51, 52 În seturile de date transcriptomice, mai multe ARN-uri necodificatoare prezintă specificitate de tip de fibră (Figura 5A și Setul de date suplimentar 15), inclusiv LINC01405, care este foarte specific pentru fibrele lente și se raportează că este scăzut în mușchii pacienților cu miopatie mitocondrială. 53 În schimb, RP11-255P5.3, corespunzătoare genei lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, prezintă specificitate de tip de fibră rapidă. Atât LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), cât și RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) prezintă specificitate a mușchilor scheletici (Figurile suplimentare 9A-B) și nu au gene contractile cunoscute în vecinătatea lor genomică de 1 Mb, ceea ce sugerează că acestea joacă un rol specializat în reglarea tipurilor de fibre, mai degrabă decât în ​​reglarea genelor contractile vecine. Profilurile de expresie lente/rapide specifice tipului de fibre ale LINC01405 și, respectiv, RP11-255P5.3 au fost confirmate folosind RNAscope (Figurile 5B-C).
A. Transcrierile ARN necodificatoare sunt reglate semnificativ în fibrele musculare cu contracție lentă și rapidă. B. Imagini reprezentative RNAscope care arată specificitatea tipului de fibre cu contracție lentă și rapidă a LINC01405 și respectiv RP11-255P5.3. Bara de scală = 50 μm. C. Cuantificarea expresiei ARN necodificatoare specifice tipului de miofibre, determinată de RNAscope (n = 3 biopsii de la indivizi independenți, comparând fibrele musculare rapide și lente în cadrul fiecărui individ). Analiza statistică a fost efectuată utilizând un test t Student bilateral. Diagramele box prezintă mediana și prima și a treia cuartilă, cu mustățile indicând valorile minime și maxime. D. Flux de lucru de identificare a proteinelor microbiene de novo (creat cu BioRender.com). E. Proteina microbiană LINC01405_ORF408:17441:17358 este exprimată specific în fibrele musculare scheletice lente (n = 5 biopsii de la participanți independenți, comparând fibrele musculare rapide și lente la fiecare participant). Analiza statistică a fost efectuată utilizând metoda modelului liniar Limm combinată cu o abordare bayesiană empirică, urmată de metoda Benjamini-Hochberg pentru comparații multiple cu ajustare a valorii p. Diagramele box prezintă mediana, primul și al treilea quartil, cu mustățile indicând valorile maxime/minime.
Recent, studiile au arătat că multe transcrieri presupuse necodificatoare codifică proteine ​​microbiene transcrise, dintre care unele reglează funcția musculară.44, 55 Pentru a identifica proteinele microbiene cu specificitate potențială de tip de fibră, am căutat în setul nostru de date proteomice de 1000 de fibre folosind un fișier FASTA personalizat care conține secvențele transcrierilor necodificatoare (n = 305) găsite în setul de date transcriptomice de 1000 de fibre (Figura 5D). Am identificat 197 de proteine ​​microbiene din 22 de transcrieri diferite, dintre care 71 au fost reglate diferențial între fibrele musculare scheletice lente și rapide (Figura suplimentară 9C și Setul de date suplimentar 16). Pentru LINC01405, au fost identificate trei produse proteice microbiene, dintre care unul a prezentat o specificitate similară pentru fibrele lente cu transcrierea sa (Figura 5E și Figura suplimentară 9D). Astfel, am identificat LINC01405 ca o genă care codifică o proteină microbiană specifică fibrelor musculare scheletice lente.
Am dezvoltat un flux de lucru cuprinzător pentru caracterizarea proteomică la scară largă a fibrelor musculare individuale și am identificat regulatori ai heterogenității fibrelor în stări sănătoase. Am aplicat acest flux de lucru pentru a înțelege modul în care miopatiile nemaline afectează heterogenitatea fibrelor musculare scheletice. Miopatiile nemaline sunt boli musculare moștenite care cauzează slăbiciune musculară și, la copiii afectați, se prezintă cu o serie de complicații, inclusiv detresă respiratorie, scolioză și mobilitate limitată a membrelor. 19,20 De obicei, în miopatiile nemaline, variantele patogene din gene precum actina alfa 1 (ACTA1) duc la o predominanță a compoziției miofibrelor cu contracție lentă, deși acest efect este eterogen. O excepție notabilă este miopatia nemalină cu troponină T1 (TNNT1), care are o predominanță a fibrelor rapide. Astfel, o mai bună înțelegere a heterogenității care stă la baza disreglării fibrelor musculare scheletice observate în miopatiile nemaline poate ajuta la dezvăluirea relației complexe dintre aceste boli și tipul de miofibre.
Comparativ cu grupul de control sănătos (n=3 per grup), miofibrele izolate de la pacienții cu miopatie nemalină cu mutații în genele ACTA1 și TNNT1 au prezentat atrofie sau distrofie miofibrelor marcată (Figura 6A, Tabelul suplimentar 3). Acest lucru a prezentat provocări tehnice semnificative pentru analiza proteomică din cauza cantității limitate de material disponibil. În ciuda acestui fapt, am reușit să detectăm 2485 de proteine ​​în 272 de miofibre scheletice. După filtrarea a cel puțin 1000 de proteine ​​cuantificate per fibră, 250 de fibre au fost supuse unei analize bioinformatice ulterioare. După filtrare, au fost cuantificate în medie 1573 ± 359 de proteine ​​per fibră (Figura suplimentară 10A, Seturi de date suplimentare 17-18). În mod notabil, în ciuda reducerii semnificative a dimensiunii fibrelor, adâncimea proteomului probelor de pacienți cu miopatie nemalină a fost redusă doar modest. Mai mult, procesarea acestor date folosind propriile noastre fișiere FASTA (inclusiv transcrieri necodificatoare) ne-a permis să identificăm cinci proteine ​​microbiene în miofibrele scheletice de la pacienții cu miopatie nemalină (Setul suplimentar de date 19). Gama dinamică a proteomului a fost semnificativ mai largă, iar proteinele totale din grupul de control au fost bine corelate cu rezultatele unei analize proteomice anterioare cu 1000 de fibre (Fig. suplimentară 10B-C).
A. Imagini microscopice care prezintă atrofia sau distrofia fibrelor și predominanța diferitelor tipuri de fibre pe baza MYH în miopatiile nemaline (NM) ACTA1 și TNNT1. Bara de scală = 100 μm. Pentru a asigura reproductibilitatea colorării la pacienții cu ACTA1 și TNNT1, biopsiile a trei pacienți au fost colorate de două până la trei ori (patru secțiuni per caz) înainte de a selecta imagini reprezentative. B. Proporțiile tipurilor de fibre la participanți pe baza MYH. C. Graficul analizei componentelor principale (PCA) al fibrelor musculare scheletice la pacienții cu miopatii nemaline și la grupul de control. D. Fibrele musculare scheletice de la pacienții cu miopatii nemaline și la grupul de control proiectate pe un grafic PCA determinat din cele 1000 de fibre analizate în Figura 2. De exemplu, grafice vulcan care compară diferențele dintre participanții cu miopatii nemaline ACTA1 și TNNT1 și grupul de control și între participanții cu miopatii nemaline ACTA1 și TNNT1. Cercurile colorate indică proteinele care au fost semnificativ diferite la π < 0,05, iar punctele întunecate indică proteinele care au fost semnificativ diferite la FDR < 0,05. Analiza statistică a fost efectuată utilizând metoda modelului liniar Limma și metode bayesiene empirice, urmată de ajustarea valorii p pentru comparații multiple utilizând metoda Benjamini-Hochberg. H. Analiza de îmbogățire a proteinelor exprimate diferențial semnificativ în întregul proteom și în fibrele de tip 1 și 2A. Analiza statistică a fost efectuată utilizând pachetul clusterProfiler și valorile p ajustate de Benjamini-Hochberg. I, J. Graficele analizei componentelor principale (PCA) colorate în funcție de termenii matricei extracelulare și ontologiei genei mitocondriale (GO).
Deoarece miopatiile nemaline pot influența proporția tipurilor de miofibre care exprimă MYH în mușchii scheletici,19,20 am examinat mai întâi tipurile de miofibre care exprimă MYH la pacienții cu miopatii nemaline și la grupul de control. Am determinat tipul de miofibre folosind o metodă imparțială descrisă anterior pentru testul cu 1000 de miofibre (Figurile suplimentare 10D-E) și, din nou, nu am reușit să identificăm miofibre 2X pure (Figura 6B). Am observat un efect eterogen al miopatiilor nemaline asupra tipului de miofibre, deoarece doi pacienți cu mutații ACTA1 au avut o proporție crescută de miofibre de tip 1, în timp ce doi pacienți cu miopatie nemalină TNNT1 au avut o proporție scăzută de miofibre de tip 1 (Figura 6B). Într-adevăr, expresia izoformelor MYH2 și a troponinei rapide (TNNC2, TNNI2 și TNNT3) a fost scăzută în miopatiile ACTA1-nemalină, în timp ce expresia MYH7 a fost scăzută în miopatiile TNNT1-nemalină (Figura suplimentară 11A). Acest lucru este în concordanță cu rapoartele anterioare privind schimbarea tipului eterogen de miofibre în miopatiile nemaline.19,20 Am confirmat aceste rezultate prin imunohistochimie și am constatat că pacienții cu miopatie ACTA1-nemalină au avut o predominanță a miofibrelor de tip 1, în timp ce pacienții cu miopatie TNNT1-nemalină au avut modelul opus (Figura 6A).
La nivelul proteomului cu o singură fibră, fibrele musculare scheletice de la pacienții cu miopatie nemalină ACTA1 și TNNT1 s-au grupat cu majoritatea fibrelor de control, fibrele cu miopatie nemalină TNNT1 fiind în general cele mai grav afectate (Figura 6C). Acest lucru a fost evident în special la reprezentarea grafică a fibrelor pseudo-umflate prin analiza componentelor principale (PCA) pentru fiecare pacient, pacienții 2 și 3 cu miopatie nemalină TNNT1 apărând cel mai distanți de probele de control (Figura suplimentară 11B, Setul de date suplimentar 20). Pentru a înțelege mai bine cum se compară fibrele de la pacienții cu miopatie cu fibrele sănătoase, am utilizat informații detaliate obținute din analiza proteomică a 1.000 de fibre de la participanți adulți sănătoși. Am proiectat fibrele din setul de date cu miopatie (pacienți și grupuri de control cu ​​miopatie nemalină ACTA1 și TNNT1) pe graficul PCA obținut din analiza proteomică a 1000 de fibre (Figura 6D). Distribuția tipurilor de fibre MYH de-a lungul PC2 în fibrele de control a fost similară cu distribuția fibrelor obținută din analiza proteomică pe 1000 de fibre. Cu toate acestea, majoritatea fibrelor la pacienții cu miopatie nemalină s-au deplasat în josul PC2, suprapunându-se cu fibrele sănătoase cu contracție rapidă, indiferent de tipul lor nativ de fibre MYH. Astfel, deși pacienții cu miopatie nemalină ACTA1 au prezentat o deplasare către fibrele de tip 1 atunci când au fost cuantificați folosind metode bazate pe MYH, atât miopatia nemalină ACTA1, cât și miopatia nemalină TNNT1 au deplasat proteomul fibrelor musculare scheletice către fibrele cu contracție rapidă.
Apoi, am comparat direct fiecare grup de pacienți cu subiecții sănătoși din grupul de control și am identificat 256 și, respectiv, 552 de proteine ​​exprimate diferențial în miopatiile nemaline ACTA1 și TNNT1 (Figura 6E-G și Figura suplimentară 11C, Setul de date suplimentar 21). Analiza îmbogățirii genelor a relevat o scădere coordonată a proteinelor mitocondriale (Figura 6H-I, Setul de date suplimentar 22). În mod surprinzător, în ciuda predominanței diferențiale a tipurilor de fibre în miopatiile nemaline ACTA1 și TNNT1, această scădere a fost complet independentă de tipul de fibră bazat pe MYH (Figura 6H și Figurile suplimentare 11D-I, Setul de date suplimentar 23). Trei proteine ​​microbiene au fost, de asemenea, reglate în miopatiile nemaline ACTA1 sau TNNT1. Două dintre aceste microproteine, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (cunoscută și sub numele de LINC00598 sau Lnc-FOXO1) și ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), au prezentat o abundență diferențială doar în miofibrele de tip 1. Anterior, s-a raportat că ENSG00000215483_TR14_ORF67 joacă un rol în reglarea ciclului celular.56 Pe de altă parte, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (corespunzător LINC01798) a fost crescut atât în ​​miofibrele de tip 1, cât și în cele de tip 2A în miopatia ACTA1-nemalină, comparativ cu subiecții sănătoși de control (Figura suplimentară 12A, Setul suplimentar de date 24). În schimb, proteinele ribozomale nu au fost în mare parte afectate de miopatia nemalină, deși RPS17 a fost reglat negativ în miopatia nemalină ACTA1 (Fig. 6E).
Analiza îmbogățirii a relevat, de asemenea, o reglare în sus a proceselor sistemului imunitar în miopatiile nemaline ACTA1 și TNNT1, în timp ce aderența celulară a fost, de asemenea, crescută în miopatia nemaline TNNT1 (Figura 6H). Îmbogățirea acestor factori extracelulari a fost reflectată de proteinele matricei extracelulare care deplasează PCA în PC1 și PC2 într-o direcție negativă (adică, spre fibrele cele mai afectate) (Figura 6J). Ambele grupuri de pacienți au prezentat o expresie crescută a proteinelor extracelulare implicate în răspunsurile imune și mecanismele de reparare sarcolemală, cum ar fi anexinele (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 și proteina lor interacționantă S100A1159 (Figurile suplimentare 12B-C). Acest proces a fost raportat anterior ca fiind amplificat în distrofiile musculare60, dar, din câte știm, nu a fost asociat anterior cu miopatiile nemaline. Funcționarea normală a acestui mecanism molecular este necesară pentru repararea sarcolemală după leziuni și pentru fuziunea miocitelor nou formate cu miofibrele58,61. Astfel, activitatea crescută a acestui proces la ambele grupuri de pacienți sugerează un răspuns reparativ la leziunile cauzate de instabilitatea miofibrelor.
Efectele fiecărei miopatii nemalinice au fost bine corelate (r = 0,736) și au prezentat o suprapunere rezonabilă (Figurile suplimentare 11A-B), indicând faptul că miopatia nemalinica ACTA1 și TNNT1 au efecte similare asupra proteomului. Cu toate acestea, unele proteine ​​au fost reglate doar în miopatia nemalinica ACTA1 sau TNNT1 (Figurile suplimentare 11A și C). Proteina profibrotică MFAP4 a fost una dintre cele mai suprareglate proteine ​​în miopatia nemalinica TNNT1, dar a rămas neschimbată în miopatia nemalinica ACTA1. SKIC8, o componentă a complexului PAF1C responsabilă de reglarea transcripției genei HOX, a fost reglată negativ în miopatia nemalinica TNNT1, dar nu a fost afectată în miopatia nemalinica ACTA1 (Figura suplimentară 11A). Compararea directă între miopatia nemalină ACTA1 și TNNT1 a evidențiat reduceri mai mari ale proteinelor mitocondriale și creșteri ale proteinelor sistemului imunitar în miopatia nemalină TNNT1 (Figura 6G-H și Figurile suplimentare 11C și 11H-I). Aceste date sunt în concordanță cu atrofia/distrofia mai mare observată în miopatia nemalină TNNT1 comparativ cu miopatia nemalină TNNT1 (Figura 6A), sugerând că miopatia nemalină TNNT1 reprezintă o formă mai severă a bolii.
Pentru a evalua dacă efectele observate ale miopatiei nemalinice persistă la nivelul întregului mușchi, am efectuat o analiză proteomică în vrac a biopsiilor musculare din aceeași cohortă de pacienți cu miopatie nemalinica TNNT1 și i-am comparat cu grupul de control (n = 3 per grup) (Fig. suplimentară 13A, Setul de date suplimentar 25). Așa cum era de așteptat, grupul de control a fost strâns legat în analiza componentelor principale, în timp ce pacienții cu miopatie nemalinica TNNT1 au prezentat o variabilitate intereșantion mai mare, similară cu cea observată în analiza fibrelor individuale (Fig. suplimentară 13B). Analiza în vrac a reprodus proteinele exprimate diferențial (Fig. suplimentară 13C, Setul de date suplimentar 26) și procesele biologice (Fig. suplimentară 13D, Setul de date suplimentar 27) evidențiate prin compararea fibrelor individuale, dar a pierdut capacitatea de a distinge între diferite tipuri de fibre și nu a reușit să țină cont de efectele eterogene ale bolii în diferite fibre.
Luate împreună, aceste date demonstrează că proteomica cu miofibre individuale poate elucida caracteristici biologice clinice care nu sunt detectabile prin metode țintite, cum ar fi imunoblottingul. Mai mult, aceste date evidențiază limitele utilizării exclusive a tipizării fibrelor de actină (MYH) pentru a descrie adaptarea fenotipică. Într-adevăr, deși schimbarea tipului de fibre diferă între miopatiile nemaline cu actină și troponină, ambele miopatii nemaline decuplează tipizarea fibrelor MYH de metabolismul fibrelor musculare scheletice către un proteom muscular mai rapid și mai puțin oxidativ.
Heterogenitatea celulară este esențială pentru ca țesuturile să își poată satisface diversele cerințe. În mușchiul scheletic, aceasta este adesea descrisă ca tipuri de fibre caracterizate prin diferite grade de producție a forței și oboseală. Cu toate acestea, este clar că acest lucru explică doar o mică parte din variabilitatea fibrelor musculare scheletice, care este mult mai variabilă, complexă și multifațetată decât se credea anterior. Progresele tehnologice au scos la iveală acum factorii care reglează fibrele musculare scheletice. Într-adevăr, datele noastre sugerează că fibrele de tip 2X ar putea să nu fie un subtip distinct de fibre musculare scheletice. Mai mult, am identificat proteinele metabolice, proteinele ribozomale și proteinele asociate celulelor ca factori determinanți majori ai heterogenității fibrelor musculare scheletice. Prin aplicarea fluxului nostru de lucru proteomic la probe de pacienți cu miopatie nematodică, am demonstrat în continuare că tipizarea fibrelor bazată pe MYH nu reflectă pe deplin heterogenitatea mușchilor scheletici, în special atunci când sistemul este perturbat. Într-adevăr, indiferent de tipul de fibră bazată pe MYH, miopatia nematodică are ca rezultat o trecere către fibre mai rapide și mai puțin oxidative.
Fibrele musculare scheletice au fost clasificate încă din secolul al XIX-lea. Analizele omice recente ne-au permis să începem să înțelegem profilurile de expresie ale diferitelor tipuri de fibre MYH și răspunsurile acestora la diferiți stimuli. Așa cum este descris aici, abordările omice au, de asemenea, avantajul unei sensibilități mai mari pentru cuantificarea markerilor de tip de fibră decât metodele tradiționale bazate pe anticorpi, fără a se baza pe cuantificarea unui singur (sau a câtorva) markeri pentru a defini un tip de fibră musculară scheletică. Am utilizat fluxuri de lucru transcriptomice și proteomice complementare și am integrat rezultatele pentru a examina reglarea transcripțională și post-transcripțională a eterogenității fibrelor în fibrele musculare scheletice umane. Acest flux de lucru a dus la eșecul identificării fibrelor pure de tip 2X la nivel proteic în vastus lateralis al cohortei noastre de tineri sănătoși. Acest lucru este în concordanță cu studiile anterioare pe fibră unică care au găsit <1% fibre 2X pure în vastus lateralis sănătos, deși acest lucru ar trebui confirmat și în alți mușchi în viitor. Discrepanța dintre detectarea fibrelor 2X aproape pure la nivel de ARNm și doar a fibrelor 2A/2X mixte la nivel proteic este derutantă. Expresia ARNm a izoformei MYH nu este circadiană,67 ceea ce sugerează că este puțin probabil să fi „ratat” semnalul de debut MYH2 în fibrele 2X aparent pure la nivel de ARN. O posibilă explicație, deși pur ipotetică, ar putea fi diferențele în stabilitatea proteinelor și/sau a ARNm între izoformele MYH. Într-adevăr, nicio fibră rapidă nu este 100% pură pentru nicio izoformă MYH și nu este clar dacă nivelurile de expresie a ARNm MYH1 în intervalul 70-90% ar duce la o abundență egală de MYH1 și MYH2 la nivel de proteine. Cu toate acestea, atunci când se ia în considerare întregul transcriptom sau proteom, analiza cluster poate identifica cu încredere doar două clustere distincte reprezentând fibrele musculare scheletice lente și rapide, indiferent de compoziția lor precisă MYH. Acest lucru este în concordanță cu analizele care utilizează abordări transcriptomice cu un singur nucleu, care identifică de obicei doar două clustere mionucleare distincte. 68, 69, 70 În plus, deși studiile proteomice anterioare au identificat fibre de tip 2X, aceste fibre nu se grupează separat de restul fibrelor rapide și prezintă doar un număr mic de proteine ​​diferențiate în abundență în comparație cu alte tipuri de fibre bazate pe MYH. 14 Aceste rezultate sugerează că ar trebui să revenim la viziunea de la începutul secolului al XX-lea asupra clasificării fibrelor musculare, care împărțea fibrele musculare scheletice umane nu în trei clase distincte bazate pe MYH, ci în două grupuri bazate pe proprietățile lor metabolice și contractile. 63
Mai important, heterogenitatea miofibrelor ar trebui luată în considerare pe mai multe dimensiuni. Studiile „omice” anterioare au indicat această direcție, sugerând că fibrele musculare scheletice nu formează grupuri discrete, ci sunt aranjate de-a lungul unui continuum. 11, 13, 14, 64, 71 Aici, arătăm că, pe lângă diferențele în proprietățile contractile și metabolice ale mușchiului scheletic, miofibrele pot fi diferențiate prin caracteristici legate de interacțiunile celulă-celulă și mecanismele de translație. Într-adevăr, am descoperit heterogenitate a ribozomilor în fibrele musculare scheletice care contribuie la heterogenitate independent de tipurile de fibre lente și rapide. Cauza care stă la baza acestei heterogenități substanțiale a miofibrelor, independentă de tipul de fibre lente și rapide, rămâne neclară, dar ar putea indica o organizare spațială specializată în cadrul fasciculelor musculare care răspund optim la forțe și încărcări specifice,72 o comunicare specializată celulară sau specifică organelor cu alte tipuri de celule din micromediul muscular73,74,75 sau diferențe în activitatea ribozomilor în cadrul miofibrelor individuale. Într-adevăr, s-a demonstrat că heteroplasmia ribozomală, fie prin substituție paralogă a RPL3 și RPL3L, fie la nivelul 2'O-metilării ARNr, este asociată cu hipertrofia mușchilor scheletici76,77. Aplicațiile multi-omice și spațiale, combinate cu caracterizarea funcțională a miofibrelor individuale, vor avansa și mai mult înțelegerea biologiei musculare la nivel multi-omic78.
Prin analizarea proteomelor miofibrelor individuale de la pacienți cu miopatii nemaline, am demonstrat, de asemenea, utilitatea, eficacitatea și aplicabilitatea proteomicii cu miofibre individuale pentru elucidarea fiziopatologiei clinice a mușchilor scheletici. Mai mult, comparând fluxul nostru de lucru cu analiza proteomică globală, am putut demonstra că proteomica cu miofibre individuale oferă aceeași profunzime a informațiilor ca și proteomica tisulară globală și extinde această profunzime ținând cont de heterogenitatea interfibrelor și de tipul de miofibre. Pe lângă diferențele așteptate (deși variabile) în raportul tipurilor de fibre observate în miopatiile nemaline ACTA1 și TNNT1 comparativ cu controalele sănătoase,19 am observat, de asemenea, remodelarea oxidativă și extracelulară independentă de schimbarea tipului de fibre mediată de MYH. Fibroza a fost raportată anterior în miopatiile nemaline TNNT1.19 Cu toate acestea, analiza noastră se bazează pe această constatare, dezvăluind și niveluri crescute de proteine ​​secretate extracelular legate de stres, cum ar fi anexinele, implicate în mecanismele de reparare sarcolemală, în miofibrele pacienților cu miopatii nemaline ACTA1 și TNNT1.57,58,59 În concluzie, nivelurile crescute de anexină în miofibrele pacienților cu miopatie nemalină pot reprezenta un răspuns celular la repararea miofibrelor sever atrofice.
Deși acest studiu reprezintă cea mai mare analiză de omică musculară integrală efectuată pe o singură fibră la oameni până în prezent, nu este lipsită de limitări. Am izolat fibrele musculare scheletice dintr-un eșantion relativ mic și omogen de participanți și dintr-un singur mușchi (vastus lateralis). Prin urmare, este imposibil să excludem existența unor populații specifice de fibre în diferite tipuri de mușchi și la extremele fiziologiei musculare. De exemplu, nu putem exclude posibilitatea apariției unui subset de fibre ultrarapide (de exemplu, fibre pure 2X) la sprinteri și/sau atleți de forță extrem de antrenați79 sau în perioadele de inactivitate musculară66,80. În plus, dimensiunea limitată a eșantionului de participanți ne-a împiedicat să investigăm diferențele de sex în heterogenitatea fibrelor, deoarece se știe că raporturile dintre tipurile de fibre diferă între bărbați și femei. În plus, nu am putut efectua analize transcriptomice și proteomice pe aceleași fibre musculare sau pe probe de la aceiași participanți. Pe măsură ce noi și alții continuăm să optimizăm analizele unicelulare și ale miofibrelor individuale folosind analiza omică pentru a obține un aport de probe ultra-scăzut (așa cum se demonstrează aici în analiza fibrelor de la pacienții cu miopatie mitocondrială), devine evidentă oportunitatea de a combina abordări multi-omice (și funcționale) în cadrul fibrelor musculare individuale.
În general, datele noastre identifică și explică factorii transcripționali și post-transcripționali care influențează heterogenitatea mușchilor scheletici. Mai exact, prezentăm date care contestă o dogmă îndelungată în fiziologia mușchilor scheletici, asociată cu definiția clasică a tipurilor de fibre bazată pe MYH. Sperăm să reînnoim dezbaterea și, în cele din urmă, să regândim înțelegerea noastră asupra clasificării și heterogenității fibrelor mușchilor scheletici.
Paisprezece participanți caucazieni (12 bărbați și 2 femei) au fost de acord în mod voluntar să participe la acest studiu. Studiul a fost aprobat de Comitetul de Etică al Spitalului Universitar din Ghent (BC-10237), a respectat Declarația de la Helsinki din 2013 și a fost înregistrat pe ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Caracteristicile generale ale participanților sunt prezentate în Tabelul suplimentar 1. După obținerea consimțământului informat verbal și scris, participanții au fost supuși unui examen medical înainte de includerea finală în studiu. Participanții erau tineri (22-42 de ani), sănătoși (fără afecțiuni medicale, fără antecedente de fumat) și moderat activi fizic. Consumul maxim de oxigen a fost determinat folosind un ergometru stepper pentru evaluarea stării fizice, așa cum s-a descris anterior.81
Probele de biopsie musculară au fost colectate în repaus și în stare de repaus alimentar de trei ori, la interval de 14 zile. Deoarece aceste probe au fost colectate ca parte a unui studiu mai amplu, participanții au consumat placebo (lactoză), un antagonist al receptorilor H1 (540 mg fexofenadină) sau un antagonist al receptorilor H2 (40 mg famotidină) cu 40 de minute înainte de biopsie. Am demonstrat anterior că acești antagoniști ai receptorilor histaminei nu afectează capacitatea musculară scheletică în repaus81 și nu s-a observat nicio grupare legată de stare în graficele noastre de control al calității (Figurile suplimentare 3 și 6). O dietă standardizată (41,4 kcal/kg greutate corporală, 5,1 g/kg greutate corporală carbohidrați, 1,4 g/kg greutate corporală proteine ​​și 1,6 g/kg greutate corporală grăsime) a fost menținută timp de 48 de ore înainte de fiecare zi experimentală, iar un mic dejun standardizat (1,5 g/kg greutate corporală carbohidrați) a fost consumat în dimineața zilei experimentale. Sub anestezie locală (0,5 ml lidocaină 1% fără epinefrină), s-au obținut biopsii musculare din mușchiul vastus lateralis utilizând aspirație percutanată Bergström.82 Probele musculare au fost imediat incluse în RNAlater și depozitate la 4°C până la disecția manuală a fibrelor (până la 3 zile).
Fasciculele de miofibre proaspăt izolate au fost transferate în mediu RNAlater proaspăt într-o placă de cultură. Miofibrele individuale au fost apoi disecate manual folosind un stereomicroscop și o pensetă fină. Douăzeci și cinci de fibre au fost disecate din fiecare biopsie, acordându-se o atenție specială selectării fibrelor din diferite zone ale biopsiei. După disecție, fiecare fibră a fost imersată ușor în 3 μl de tampon de liză (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) care conține enzime proteinază K și DNază pentru a îndepărta proteinele și ADN-ul nedorite. Liza celulară și îndepărtarea proteinelor/ADN-ului au fost apoi inițiate printr-o scurtă agitare prin vortexare, centrifugare a lichidului într-o microcentrifugă și incubare la temperatura camerei (10 min). Lizatul a fost apoi incubat într-un termociclator (T100, Bio-Rad) la 37°C timp de 5 min, 75°C timp de 5 min și apoi depozitat imediat la -80°C până la procesarea ulterioară.
Bibliotecile de ARN poliadenilat compatibile cu Illumina au fost preparate din 2 µl de lizat de miofibre folosind kitul de pregătire a bibliotecii QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen). Metodele detaliate pot fi găsite în manualul producătorului. Procesul începe cu sinteza ADNc a primei catene prin transcripție inversă, timp în care se introduc identificatori moleculari unici (UMI) și coduri de bare i1 specifice probei pentru a asigura gruparea probelor și a reduce variabilitatea tehnică în timpul procesării ulterioare. ADNc-ul din 96 de miofibre este apoi grupat și purificat cu bile magnetice, după care ARN-ul este îndepărtat și se efectuează sinteza celei de-a doua catene folosind primeri aleatorii. Biblioteca este purificată cu bile magnetice, se adaugă etichete i5/i7 specifice grupului și se amplifică prin PCR. O etapă finală de purificare produce biblioteci compatibile cu Illumina. Calitatea fiecărui grup de biblioteci a fost evaluată folosind kitul de analiză a ADN pentru fragmente mici de înaltă sensibilitate (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Pe baza cuantificării Qubit, seturile au fost grupate în continuare la concentrații echimolare (2 nM). Setul rezultat a fost apoi secvențiat pe un instrument NovaSeq 6000 în mod standard utilizând kitul de reactivi NovaSeq S2 (1 × 100 nucleotide) cu o încărcare de 2 nM (4% PhiX).
Canalul nostru de lucru se bazează pe canalul de analiză a datelor QuantSeq Pool de la Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Datele au fost mai întâi demultiplexate cu bcl2fastq2 (v2.20.0) pe baza indexului i7/i5. Citirea 2 a fost apoi demultiplexată cu idemux (v0.1.6) pe baza codului de bare al eșantionului i1, iar secvențele UMI au fost extrase cu umi_tools (v1.0.1). Citirile au fost apoi decupate cu cutadapt (v3.4) în runde multiple pentru a elimina citirile scurte (<20 în lungime) sau citirile constând exclusiv din secvențe adaptoare. Citirile au fost apoi aliniate la genomul uman folosind STAR (v2.6.0c), iar fișierele BAM au fost indexate cu SAMtools (v1.11). Citirile duplicate au fost eliminate folosind umi_tools (v1.0.1). În final, numărarea alinierilor a fost efectuată folosind featureCounts în Subread (v2.0.3). Controlul calității a fost efectuat folosind FastQC (v0.11.9) în mai multe etape intermediare ale producției.
Toate procesările și vizualizările bioinformatice ulterioare au fost efectuate în R (v4.2.3), utilizând în principal fluxul de lucru Seurat (v4.4.0).83 Prin urmare, valorile UMI individuale și matricile de metadate au fost transformate în obiecte Seurat. Genele exprimate în mai puțin de 30% din totalul fibrelor au fost eliminate. Probele de calitate scăzută au fost eliminate pe baza unui prag minim de 1000 de valori UMI și 1000 de gene detectate. În cele din urmă, 925 de fibre au trecut toate etapele de filtrare a controlului calității. Valorile UMI au fost normalizate utilizând metoda Seurat SCTransform v2,84 incluzând toate cele 7418 de caracteristici detectate, iar diferențele dintre participanți au fost regresate. Toate metadatele relevante pot fi găsite în Setul de date suplimentar 28.